Sepsis lösen

Nature Biomedical Engineering (2023)Diesen Artikel zitieren

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Bei der Immunparalyse handelt es sich um eine kompensatorische und anhaltende entzündungshemmende Reaktion auf ein Trauma, eine Sepsis oder eine andere schwere Verletzung, die das Risiko opportunistischer Infektionen sowie Morbidität und Mortalität erhöht. Hier zeigen wir, dass Interleukin-4 (IL4) in kultivierten primären menschlichen Monozyten akute Entzündungen hemmt und gleichzeitig ein langanhaltendes angeborenes Immungedächtnis induziert, das als trainierte Immunität bezeichnet wird. Um diese paradoxe IL4-Funktion in vivo zu nutzen, haben wir ein Fusionsprotein aus Apolipoprotein A1 (apoA1) und IL4 entwickelt, das in ein Lipid-Nanopartikel integriert wird. Bei Mäusen und nichtmenschlichen Primaten zielt ein intravenös injiziertes ApoA1-IL4-einbettendes Nanopartikel auf myeloische zellreiche hämatopoetische Organe, insbesondere Milz und Knochenmark. Anschließend zeigen wir, dass die IL4-Nanotherapie die Immunparalyse bei Mäusen mit Lipopolysaccharid-induzierter Hyperinflammation sowie in Ex-vivo-Sepsismodellen beim Menschen und bei experimenteller Endotoxämie auflöste. Unsere Ergebnisse unterstützen die translationale Entwicklung von Nanopartikelformulierungen von ApoA1-IL4 zur Behandlung von Patienten mit Sepsis, bei denen das Risiko immunparalysebedingter Komplikationen besteht.

Sepsis ist eine schwere Erkrankung, die durch eine fehlregulierte Reaktion des Wirts auf eine Infektion verursacht wird und häufig zu Organversagen und Tod führt1. Aufgrund der Unfähigkeit des Immunsystems, einen Krankheitserreger zu beseitigen, können bei Patienten mit Sepsis gleichzeitig hyperinflammatorische und immunsuppressive Eigenschaften auftreten, was die Behandlung dieser Erkrankung äußerst schwierig macht2,3,4. Bis zu 30–40 % der Patienten mit Sepsis weisen einen überwiegenden Immunparalyse-Phänotyp auf. Die Immunparalyse zeichnet sich durch eine anhaltende entzündungshemmende angeborene Immunantwort nach einem Vorfall wie einer Sepsis aus5, wodurch die Patienten einem hohen Risiko wiederkehrender und sekundärer Infektionen ausgesetzt sind, die häufig zu Organfunktionsstörungen und zum Tod führen6.

Therapeutische Strategien zur Wiederherstellung des Gleichgewichts der Immunantworten bei Sepsis und zur Verbesserung der Patientenergebnisse durch Immuntherapie stecken noch in den Kinderschuhen. Jüngste experimentelle Arbeiten legen nahe, dass die langfristige Neuprogrammierung der angeborenen Immunzellen7,8, ein Prozess, der als „trainierte Immunität“9,10 bezeichnet wird, in der Lage sein könnte, die durch übertriebene bakterielle Stimulation verursachte Toleranz und Immunparalyse umzukehren11. Obwohl die therapeutisch induzierte trainierte Immunität12 theoretisch eine überzeugende Strategie zur Überwindung der Immunparalyse darstellt, besteht ein dringender Bedarf an Ansätzen, die sicher und effizient auf klinische Situationen übertragen werden können.

In unserem Bestreben, Hyperentzündung und Immunparalyse gleichzeitig zu beheben, haben wir Interleukin-4 (IL4) zur Modulation der trainierten Immunität und Toleranz in Betracht gezogen. Bei der Neubewertung der berichteten direkten Wirkungen dieses Zytokins auf Monozyten in vitro13,14,15 stellten wir fest, dass IL4 paradoxerweise zusätzlich zu seinen bekannten entzündungshemmenden Wirkungen eine trainierte Immunität induziert. Wir stellten die Hypothese auf, dass die einzigartigen Eigenschaften von IL4 genutzt werden könnten, um die durch Stimulation mit bakteriellem Endotoxin (Lipopolysaccharid (LPS)) induzierte Immunparalyse in Monozyten zu überwinden. Allerdings ist natürliches IL4 aufgrund seiner ungünstigen pharmakokinetischen Eigenschaften und der breiten IL4-Rezeptor (IL4R)-Expression für die therapeutische Regulierung myeloischer Zellen in vivo schlecht geeignet. Die direkte Weiterleitung von IL4 in das myeloische Kompartiment ist daher ein attraktiver therapeutischer Weg. Zur Unterstützung dieses Konzepts entwickelten wir ein Fusionsprotein aus Apolipoprotein A1 (apoA1) – dem Hauptproteinbestandteil von High-Density-Lipoprotein – und IL4 und nannten dieses Konstrukt „apoA1–IL4“16,17. Das ApoA1-IL4-Fusionsprotein lässt sich leicht in Lipid-Nanopartikel integrieren, um myeloische zellfressende IL4-Nanopartikel zu erzeugen. Anschließend untersuchten wir das Verhalten der IL4-Nanopartikel in Mäusen und nichtmenschlichen Primaten mithilfe der In-vivo-Positronenemissionstomographie (PET)-Bildgebung und der quantitativen Gammazählung ex vivo. Schließlich untersuchten wir das therapeutische Potenzial der IL4-Nanopartikel bei multiplen translatorischen Entzündungen sowie in vivo- und ex vivo-Modellen der Sepsis.

Im Zusammenhang mit der Immunologie myeloischer Zellen ist IL4 vor allem für seine entzündungshemmenden Eigenschaften bekannt13,14,15. Daher haben wir zunächst mehrere bekannte hemmende Wirkungen von IL4 auf Entzündungen in primären menschlichen Monozyten validiert (Abb. 1a). Wir stimulierten mit Percoll angereicherte Monozyten 24 Stunden lang mit LPS in Gegenwart oder Abwesenheit von IL4 (25 ng ml−1). Wie erwartet hemmte IL4 wirksam die Sekretion der proinflammatorischen Zytokine Tumornekrosefaktor (TNF) und IL6 (Abb. 1b). Interessanterweise sezernierten IL4-behandelte Zellen im Vergleich zu Kontrollen deutlich mehr IL-1Ra (Abb. 1b). Da die Glykolyse in aktivierten myeloischen Zellen hochreguliert ist18, haben wir die Laktatproduktion in ansonsten nicht stimulierten Monozyten gemessen, die mit IL4 oder einer Mediumkontrolle behandelt wurden. Wir fanden heraus, dass IL4 die Ausgangs-Laktatproduktion leicht, aber deutlich senkt (Extended Data Abb. 1a), was seine akuten entzündungshemmenden Eigenschaften bestätigt.

a, Schematische Darstellung direkter In-vitro-Entzündungsexperimente. b, TNF-, IL6- und IL1Ra-Spiegel nach 24-stündiger Stimulation menschlicher primärer Monozyten. c, Schematische Darstellung von in-vitro-trainierten Immunitätsexperimenten. d, TNF- und IL6-Spiegel nach erneuter Stimulation von β-Glucan-trainierten Zellen. e, TNF- und IL6-Spiegel nach erneuter Stimulation von IL4-trainierten Zellen. f, Seahorse-Analyse des glykolytischen (links) und mitochondrialen (rechts) Stoffwechsels in IL4-trainierten Zellen. Die Daten werden als Mittelwert ± SD OCR, Sauerstoffverbrauchsrate dargestellt; 2-DG, 2-Desoxy-D-Glucose.

Aufgrund dieser entzündungshemmenden Eigenschaften stellten wir die Hypothese auf, dass IL4 auch die Induktion einer trainierten Immunität hemmen könnte (Abb. 1c). Um diese Hypothese zu testen, wurden Monozyten 24 Stunden lang mit β-Glucan, einem prototypischen trainierten Immunstimulus, trainiert, gefolgt vom Abwaschen des Stimulus und einer fünftägigen Ruhephase im Kulturmedium. Am 6. Tag stimulierten wir die Zellen weitere 24 Stunden lang mit LPS und maßen TNF und IL6 (Abb. 1d). Während β-Glucan wie erwartet eine trainierte Immunität induzierte, hemmte die Zugabe von IL4 in den ersten 24 Stunden den Trainingseffekt nicht (Abb. 1d). Im Gegensatz zu unserer ursprünglichen Hypothese induzierte die 24-stündige Exposition von Monozyten gegenüber IL4 allein am Tag 6 einen trainierten Immunitätsphänotyp (Abb. 1e). Neben einer erhöhten Produktion entzündungsfördernder Zytokine produzierten IL4-trainierte Zellen zu Studienbeginn mehr Laktat (Erweiterte Daten, Abb. 1b). Darüber hinaus waren IL4-trainierte Zellen bei der Phagozytierung hitzegetöteter Candida albicans etwas weniger wirksam als nicht trainierte Kontrollen (Extended Data, Abb. 1c). Insgesamt zeigen unsere Daten, dass IL4 Entzündungen hemmt und eine trainierte Immunität induziert, sowohl auf metabolischer als auch auf funktioneller immunologischer Ebene.

Ermutigt durch diese Beobachtungen untersuchten wir umfassend die Stoffwechselveränderungen nach einer IL4-induzierten trainierten Immunität. Zu diesem Zweck verwendeten wir Seahorse-Stoffwechselflussanalysen, um den glykolytischen und oxidativen Stoffwechsel von IL4-trainierten Zellen und unstimulierten Kontrollen zu untersuchen. Das IL4-Training am Tag 0 hatte einen deutlichen Einfluss auf die am Tag 6 gemessenen Stoffwechselparameter (Abb. 1f), mit einem Trend zu einer höheren basalen Glykolyse und einem signifikanten Anstieg der durch Oligomycin ausgelösten maximalen Glykolysekapazität (Abb. 1f, links). Darüber hinaus wurden sowohl die durch Baseline als auch durch Carbonylcyanid-p-Trifluormethoxyphenylhydrazon ausgelösten maximalen Atemfrequenzen durch IL4-Training deutlich gesteigert (Abb. 1f; rechts).

Anschließend verwendeten wir Durchflusszytometrie, um mehrere Parameter zu messen, die üblicherweise mit der IL4-Aktivierung von Monozyten und Makrophagen verbunden sind (Extended Data, Abb. 1d). Das IL4-Training verursachte am 6. Tag eine starke Herunterregulierung der Expression des Differenzierungsclusters (CD)14. Im Gegensatz dazu waren CD200R und insbesondere CD206 am 6. Tag nach der IL4-Aktivierung am Tag 0 deutlich erhöht. CD80 wurde durch das IL4-Training geringfügig, aber insgesamt erhöht Die Expression dieser ansonsten naiven Makrophagen war immer noch gering. Es ist bekannt, dass von Monozyten abgeleitete dendritische Zellen (moDCs, die mithilfe von IL4+Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierendem Faktor (GM-CSF) differenziert werden) ebenfalls CD14 herunterregulieren, während sie CD1c stark hochregulieren. Mit IL4 trainierte Zellen exprimierten etwas mehr CD1c als untrainierte Zellen, aber weit weniger als moDCs (Extended Data Abb. 1e). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass IL4 ein Programm der trainierten Immunität induziert, das Merkmale umfasst, die aus den klassischen immunologischen Funktionen von IL4 bekannt sind.

Die Signalmechanismen von IL4 sind gut beschrieben: die Achse des Insulinrezeptorsubstrats 2-Phosphoinositid-3-Kinasen-Säugetierziel von Rapamycin (IRS-2–PI3K–mTOR) und der Signaltransducer und Aktivator der Transkription 6 (STAT6)-Signalweg19 (Abb . 2a). Wir führten pharmakologische Hemmungsexperimente durch, um die Rolle dieser Signalwege sowohl für die Hemmung akuter Entzündungen als auch für die Induktion der trainierten Immunität durch IL4 zu untersuchen. Die Hemmung von PI3K oder mTOR (unter Verwendung von Wortmannin bzw. Torin-1) hob die Wirkung von IL4 auf akute Entzündungen nicht auf, verringerte jedoch die trainierten Immunantworten (Abb. 2b, c und Extended Data Abb. 2a). Das IL4-Training, gemessen an einer erhöhten TNF- und IL6-Produktion, wurde in Gegenwart von Torin-1 deutlich abgeschwächt (Abb. 2c und erweiterte Daten Abb. 2b). Im Gegensatz dazu stellte der STAT6-Inhibitor AS1517499 die Zytokinproduktion bei akuten Entzündungsreaktionen teilweise wieder her, hatte jedoch keinen Einfluss auf die Induktion der trainierten Immunität durch IL4 (Abb. 2b, c). Somit hat jeder der Signalwege, die stromabwärts der IL4-Interaktion mit seinen Rezeptoren induziert werden, unterschiedliche Funktionen: IL4 übt seine bekannte akute entzündungshemmende Funktion durch STAT6 aus, induziert aber gleichzeitig eine trainierte Immunität über PI3K-mTOR, eine bisher unbekannte entzündungsfördernde Wirkung.

a, Schematischer Überblick über die zuvor beschriebenen wichtigsten IL4-Signalwege19. Erstellt mit Biorender. b, TNF- und IL6-Spiegel nach 24-stündiger Stimulation von Monozyten bei gleichzeitiger Blockierung wichtiger IL4-Signalwege. c, TNF- und IL6-Spiegel nach erneuter Stimulation von Zellen, die mit IL4 trainiert wurden, während sie wichtige IL4-Signalwege blockierten. d, Wärmekarte des Transkriptoms von IL4-trainierten Zellen vor und nach der erneuten Stimulation. e, TF-Motivanreicherungsanalyse bei IL4-trainierter Immunität (Heatmap zeigt Z-Scores an). f, Pathway-Anreicherungsanalysen des IL4-trainierten Immunitätstranskriptoms. g, TNF- und IL6-Spiegel nach erneuter Stimulation von Zellen, die mit IL4 in Gegenwart eines SET7-Methyltransferase-Inhibitors trainiert wurden. CPH, Cyproheptadin. h, ChIP-qPCR AUC-Analyse von TNF in IL4-trainierten Zellen. Daten in Balkendiagrammen werden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt

Um einen Einblick in das durch das IL4-Training induzierte molekulare Programm zu erhalten, führten wir eine Transkriptomanalyse an naiven und IL4-trainierten Makrophagen durch, sowohl vor als auch nach der erneuten LPS-Stimulation am Tag 6. Insgesamt wurden 140 Gene stärker induziert („hochreguliert“) IL4-trainierte Makrophagen, wohingegen 249 Gene abgeschwächt waren (Abb. 2d). Zu den am stärksten hochregulierten Genen gehörten entzündungsfördernde Zytokine wie IL6 und IL12B, von denen bekannt ist, dass sie an der trainierten Immunität beteiligt sind10. Zu den prominenten abgeschwächten Genen gehörten CCL19 und SOCS2, die für den Lymphozytentransport bzw. die Unterdrückung der Zytokinsignalisierung wichtig sind20,21.

Als nächstes führten wir eine Transkriptionsfaktor (TF)-Motivanreicherungsanalyse (Abb. 2e) sowie Genontologie- und Signalweganreicherungsanalysen (Abb. 2f) durch, um weitere Einblicke in die Transkriptomprofile zu erhalten. Promotoren von Genen, die in IL4-trainierten Makrophagen hochreguliert wurden, waren stark mit Motiven angereichert, die von TFs erkannt wurden, wie z. B. dem aktivierenden Transkriptionsfaktor (ATF)2/ATF7, dem Peroxisom-Proliferator-aktivierten Rezeptor Alpha (PPARα) und STAT5, während dies bei Motiven des Interferon-Regulierungsfaktors (IRF) der Fall war besonders erschöpft. Dieses Muster war bei nicht betroffenen und abgeschwächten Genen größtenteils umgekehrt, mit Ausnahme von TATA-Box, Nuclear Factor Kappa-Light-Chain-Enhancer aktivierter B-Zellen (NFκB)-p65, NFκB-p65-Rel und fos-verwandtem Antigen 2: diese Motive waren stark an abgeschwächten Genpromotoren angereichert, nahmen jedoch sowohl an nicht betroffenen als auch an hochregulierten Genen ab (Abb. 2e). Die Genontologie (biologischer Prozess (BP) und molekulare Funktion (MF)) und die Signalweganreicherung der Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes zeigten, dass in beiden hochregulierten Bereichen immunologische Aktivitäten vorhanden waren (z. B. BP „Reaktion auf den Organismus“, Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes). „TNF-Signalisierung“) und abgeschwächten (z. B. BP „Immunantwort“, MF „Zytokinaktivität“) Gensätze (Abb. 2f). Wir führten eine ähnliche Transkriptomanalyse an Monozyten durch, die unmittelbar nach der Isolierung mit IL4, LPS oder IL4 und LPS in Kombination stimuliert wurden, was eine akute entzündungshemmende transkriptomische Reaktion auf IL4 bestätigte (Extended Data Abb. 2c – e). Zusammengenommen zeigen diese Daten spezifische Transkriptionsprogramme sowohl bei den akuten entzündungshemmenden Wirkungen als auch bei den durch IL4 hervorgerufenen langfristigen trainierten Immunantworten.

Anschließend untersuchten wir die Bedeutung und das Vorhandensein epigenetischer Reprogrammierung, insbesondere von Histonmodifikationen. Die Zugabe des Antiallergikums Cyproheptadin, einem Su(var)3-9, Enhancer of Zeste und Trithorax-Domäne, der Lysin-Methyltransferase 7 (SET7) (auch bekannt als SET9) Histon-Methyltransferase-Inhibitor enthält, hob die Induktion der trainierten Immunität auf durch IL4 (Abb. 2g). SET7 wurde bereits früher als wichtiger epigenetischer Mediator der trainierten Immunität beschrieben22. Darüber hinaus untersuchten wir die durch Histon-3-Lysin-9-trimethylierung (H3K9me3) vermittelte Repression von TNF mithilfe von Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) und quantitativen PCR (qPCR)-Analysen bei IL4-induzierter trainierter Immunität. Die Analyse der Fläche unter der Kurve (AUC) von sechs Primerpaaren zeigte eine Abnahme von H3K9me3 in der IL4-induzierten trainierten Immunität, obwohl dies keine statistische Signifikanz erreichte (Abb. 2h und erweiterte Daten Abb. 2f). Zusammengenommen deuten diese Daten darauf hin, dass die epigenetische Neuprogrammierung für die IL4-induzierte trainierte Immunität von entscheidender Bedeutung und charakteristisch ist.

Trotz seiner Fähigkeit, akute Entzündungen zu hemmen und gleichzeitig eine trainierte Immunität zu induzieren, wird die klinische Umsetzung von rekombinantem IL4 durch seine ungünstigen pharmakokinetischen Eigenschaften behindert. Um diese Einschränkung zu überwinden, haben wir ein Fusionsprotein auf ApoA1-Basis entwickelt, das sich leicht in Lipid-Nanopartikel integrieren lässt, um IL4-haltige Nanopartikel (IL4-aNPs) zu ergeben. ApoA1-basierte Nanopartikel (aNPs) reichern sich von Natur aus in hämatopoetischen Organen an und zielen effizient auf myeloische Zellen und ihre Vorläufer ab16,23 (Abb. 3a). Konkret haben wir ein Fusionsprotein entworfen, das aus menschlichem ApoA1 und menschlichem IL4 (ApoA1–IL4) besteht, die über einen flexiblen Linker verbunden und von zwei Reinigungs-Tags flankiert sind, einem 6his-Tag am N-Terminus und einem Strep-Tag am C-Terminus ( Abb. 3b). Wir verwendeten molekulare Charakterisierungstechniken, um die Natur und Reinheit von ApoA1–IL4 zu bestätigen. Durch die Durchführung einer Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) an jeder gereinigten Proteinprobe bestätigten wir das Vorhandensein von Proteinen mit Molekulargewichten von 25 kDa (apoA1), 18 kDa (IL4) und 37 kDa (apoA1–IL4) ( Abb. 3c), während Western Blots das Vorhandensein von ApoA1 und IL4 anzeigten (Abb. 3d). Aufgrund seiner amphiphilen Natur laufen ApoA1 und seine Derivate während der Gelelektrophorese schneller ab als Proteine ​​ähnlicher Größe. Diese Beobachtungen wurden durch Quadrupol-Flugzeitmassenspektrometrie (Q-ToF) (MS) bestätigt, die einen einzelnen Massenpeak bei 47.576,03 Da zeigte, was einem Molekulargewicht von 47.582,57 Da für ApoA1–IL4 entspricht (Abb. 3e).

a, Schematischer Überblick über die ApoA1-basierte Fusionsproteintechnologie. b, Schematische Darstellung der Struktur des ApoA1-IL4-Fusionsproteins. c,d SDS-PAGE (c) und Western Blot (d) rekombinant exprimierter Proteine. Antikörper, die spezifisch für endogenes IL4 und ApoA1 sind. e, Chromatogramm und Q-ToF-MS-Spektrum von ApoA1–IL4. f, Kinetik der Bindung von ApoA1–IL4 an IL4Rα unter Verwendung von SPR. g, Aktivierung von HEK-Blue-Zellen, die IL4Rα und IL13Rα1 exprimieren, durch ApoA1–IL4. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung DMPC, 1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholin; GGS, Glycin-Glycin-Serin; RU, Resonanzeinheiten.

Vor der Integration von ApoA1–IL4 in Lipidnanopartikel wurden biophysikalische und zelluläre Analysen – unter Verwendung von Oberflächenplasmonenresonanz (SPR) und HEK-Blue IL4/IL13 (HEK-IL4)-Reporterzellen – durchgeführt, um den Erhalt der biologischen Aktivität nach der Extraktion und Reinigung zu bestimmen und Rückfaltungsprozess. Wir haben die Gleichgewichtsdissoziationskonstanten KD von ApoA1–IL4 gegenüber dem menschlichen IL4-Rezeptor Alpha (IL4Rα) mithilfe von SPR auf 4,5 ± 1,1 nM bestimmt (Abb. 3f). HEK-IL4-Zellen besitzen ein IL4Rα/STAT6-induzierbares Reportergen, das für die sekretierte alkalische Phosphatase (SEAP) kodiert, das sie bei der Einführung von ApoA1–IL4 in ihre Kulturvertiefungen deutlich produzierten. Dies weist auf die biologische Aktivität von ApoA1–IL4 hin (Abb. 3g). Obwohl die Fusion mit ApoA1 die biophysikalischen Eigenschaften von IL4 erheblich veränderte und die Integration in Lipid-Nanopartikel ermöglichte, blieb die Bindung an seinen Rezeptor mit einem KD von 0,28 ± 0,1 nM erhalten (Extended Data Abb. 3a). Zusammenfassend haben wir ein ApoA1-IL4-Fusionsprotein entwickelt, das die biologischen Aktivitäten von IL4 nach der Extraktion, Reinigung und Rückfaltung beibehält und die gewünschten physikalisch-chemischen Eigenschaften für seine Integration in Lipid-Nanopartikel durch ApoA1 enthält.

Um die pharmakokinetischen Eigenschaften von IL4 und seine Bioverfügbarkeit für myeloische Zellen zu verbessern, haben wir das ApoA1-IL4-Fusionsprotein in Lipid-Nanopartikel integriert, um IL4-aNPs16 zu erhalten. Durch Variation der Zusammensetzung der Formulierungen wurden Nanopartikel unterschiedlicher Größe und Morphologie erhalten (Abb. 4a). Die Bildung scheibenförmiger und kugelförmiger Nanopartikel wurde durch kryogene Transmissionselektronenmikroskopie (Kryo-TEM) bestätigt (Abb. 4b). Darüber hinaus haben wir die Größe und Stabilität der Nanopartikel in PBS 14 Tage lang mithilfe der dynamischen Lichtstreuung (DLS) analysiert (Abb. 4c, d). IL4-aNPs bleiben 14 Tage lang stabil und haben eine ähnliche Größe und Stabilität im Vergleich zu unseren zuvor berichteten herkömmlichen aNPs (Extended Data Abb. 4a,b).

a,b, Schematische Darstellung (a) und Kryo-TEM-Bilder (b) von scheibenförmigen (oberes Feld) und kugelförmigen IL4-aNPs (unteres Feld). c,d, IL4-aNP-Größenverteilung (c) und Stabilität (d) von IL4-aNPs über die Zeit, bestimmt durch DLS. Die IL4-aNP-Größe wird als Zahlenmittel angegeben. e: Bilder mit hochauflösender Fluoreszenzmikroskopie (dSTORM) von menschlichen Monozyten, die entweder mit fluoreszierend markierten ApoA1(-IL4)- oder (IL4-)aNPs (rot) inkubiert und mit Anti-IL4Rα-Antikörper (grün) gefärbt wurden. Die Co-Lokalisierung zwischen den Proteinen und IL4Rα ist in Gelb zu erkennen. Weiße ROIs werden in den nachfolgenden Bildern rechts vergrößert. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt

Als nächstes untersuchten wir die Wechselwirkung von IL4-aNPs mit primären menschlichen Monozyten. Die Analyse der direkten stochastischen optischen Rekonstruktionsmikroskopie (dSTORM) ergab die Expression von IL4Rα (grün) auf der Membran. Darüber hinaus wurde die Bindung von nacktem ApoA1, nacktem ApoA1–IL4, aNPs und IL4-aNPs (rot) durch den die Zelloberfläche bedeckenden Rand bestätigt. Als wir uns auf einen vergrößerten Abschnitt der Membran konzentrierten, stellten wir fest, dass nackte ApoA1-IL4- und IL4-aNPs mit dem IL4Rα assoziiert waren und angereicherte Co-Cluster auf der Zelloberfläche bildeten, was wir bei nacktem ApoA1 und herkömmlichen aNPs nicht beobachteten (Abb. 4e). Zusammengenommen zeigten DLS-Größenstabilitätstests, Kryo-TEM- und dSTORM-Analysen, dass die Integration des ApoA1-IL4-Fusionsproteins in Lipid-Nanopartikel biologisch funktionelle IL4-aNPs ergibt.

Um die Pharmakokinetik und Bioverteilung bei C57BL/6-Mäusen zu untersuchen, haben wir die Proteinkomponente von vier verschiedenen IL4-Therapeutika, nämlich nacktes IL4, das nackte ApoA1-IL4-Fusionsprotein und scheibenförmige und kugelförmige IL4-aNPs, mit Zirkonium-89 (89Zr) radioaktiv markiert. Beachten Sie, dass diese Experimente mit der menschlichen Variante von IL4 durchgeführt wurden, die bei Mäusen keine biologische Aktivität zeigt. PET mit Computertomographie (PET-CT) 24 Stunden nach der intravenösen Verabreichung zeigte, dass sich 89Zr-IL4 und 89Zr-apoA1–IL4 hauptsächlich in Niere und Leber anreicherten. Im Gegensatz dazu reichern sich 89Zr-IL4-aNPs nicht nur in Leber und Niere an, sondern auch in relativ größeren Mengen in immunzellreichen Organen, einschließlich Milz und Knochenmark (Abb. 5a). Wir führten eine Ex-vivo-Gammazählung durch, um die Bluthalbwertszeit und Aufnahme der Nanomaterialien in wichtige Organe zu bestimmen (Abb. 5b, c), was wir durch Autoradiographie bestätigten (Extended Data Abb. 5a). Ein Vergleich der Aufnahmeverhältnisse nach Zielorganen (Knochenmark + Milz), geteilt durch Clearance-Organe (Niere + Leber), zeigte einen signifikanten Anstieg des Aufnahmeverhältnisses für IL4-aNP-Formulierungen im Vergleich zu unformuliertem Fusionsprotein und reinem IL4 (Extended Data Abb. 5c). Als nächstes verwendeten wir Durchflusszytometrie, um die zelltypspezifische Bioverteilung in Zielorganen zu messen. Mit 3,3′-Dioctadecyloxacarbocyaninperchlorat (DiO) markierte scheibenförmige IL4-aNPs reichern sich in myeloischen Zellen, insbesondere Monozyten und Neutrophilen, sowohl in der Milz als auch im Knochenmark an, während sie nicht (oder nur geringfügig) mit Lymphozyten interagieren (Abb. 5d). ). Aufgrund seiner günstigen (und myeloidspezifischen) Aufnahme in hämatopoetischen Organen haben wir die diskoidale IL4-aNP-Formulierung für weitere Studien an nichtmenschlichen Primaten und translationalen Modellen für Entzündung und Sepsis ausgewählt.

a, PET-CT-Rendering 24 Stunden nach der Injektion von 89Zr-markierten Konstrukten. b, Bluthalbwertszeit des 89Zr-markierten Konstrukts (n = 5, angepasst an eine Zweiphasen-Zerfallsfunktion). ID, injizierte Dosis. c, Ex-vivo-Gammazählung von Geweben 24 Stunden nach der Injektion des 89Zr-markierten Konstrukts (n = 5), die Zahl stellt das Verhältnis von Ziel- zu Clearance-Organen dar. d, Zelltypspezifische Bioverteilung von DiO-markierten diskoiden IL4-aNPs in Milz und Knochenmark, gemessen mittels Durchflusszytometrie. e, 89Zr-IL4-aNP-Bluthalbwertszeit bei nichtmenschlichen Primaten. f, Organ-SUV-Mittelwert über die Zeit bei mit 89Zr-IL4-aNPs injizierten nichtmenschlichen Primaten (n = 2). g, Organspezifischer SUV-Mittelwert 48 Stunden nach der Injektion von 89Zr-IL4-aNPs in nichtmenschliche Primaten (n = 2). h, PET-MRT-Scan eines nichtmenschlichen Primaten 48 Stunden nach der Injektion von 89Zr-IL4-aNPs. Die Daten werden gegebenenfalls als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt. DIO, 3,3′-Dioctadecyloxacarbocyaninperchlorat; MFI, mittlere Fluoreszenzintensität; NHP, nichtmenschlicher Primat.

Um die klinische Übertragbarkeit von IL4-aNP-Immuntherapeutika zu bewerten, haben wir deren Bioverteilung und Sicherheitsprofil bei nichtmenschlichen Primaten bestimmt. Zwei nichtmenschlichen Primaten wurden 89Zr-IL4-aNPs intravenös injiziert. Ihr In-vivo-Verhalten wurde mithilfe vollständig integrierter dreidimensionaler PET in Kombination mit Magnetresonanztomographie (PET-MRT) untersucht. Nach der Injektion zeigte die dynamische PET-MRT (Extended Data Abb. 5d) eine schnelle Akkumulation von IL4-aNPs in Leber, Niere (Extended Data Abb. 5e), Milz und Knochenmark (Abb. 5e – h). In Übereinstimmung mit den Mausdaten wurde keine unerwünschte Aufnahme von IL4-aNPs in Nichtzielorganen, einschließlich Gehirn und Herz, beobachtet (Extended Data Abb. 5b). Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass die günstige Bioverteilung und das Sicherheitsprofil von IL4-aNP speziesübergreifend erhalten bleiben, was das Translationspotenzial dieser Immuntherapie bestätigt.

Nachdem wir festgestellt hatten, dass natürliches IL4 gleichzeitig akute Entzündungsreaktionen dämpft und ein Programm trainierter Immunität induziert, untersuchten wir die Auswirkungen der IL4-aNPs-Effekte auf Monozyten in vitro (Abb. 6a). Wir basierten die Dosis für In-vitro-Experimente auf der Effizienz der Phospho-STAT6-Induktion in primären menschlichen Monozyten im Vergleich zu reinem IL4 (Erweiterte Daten, Abb. 6a). Tatsächlich reduzierten IL4-aNPs (molares Äquivalent von 200 ng ml−1 reines IL4) die TNF- und IL6-Produktion von LPS-stimulierten Monozyten signifikant (Abb. 6b) und verbesserten gleichzeitig die langfristige Reaktionsfähigkeit der Monozyten am Tag 6 (Abb. 6c). . Diese Daten deuten darauf hin, dass IL4-aNPs, ähnlich wie IL4, akute Entzündungen unterdrücken und in vitro eine trainierte Immunität induzieren. Obwohl In-vivo-Bioverteilungsdaten zeigen, dass IL4-aNPs spezifisch auf myeloische Zellen abzielen (Abb. 5d), verändert die IL4-induzierte trainierte Immunität die Oberflächenmarkerexpression von Makrophagen, bei denen es sich um Antigen-präsentierende Zellen handelt (Extended Data Abb. 1d, e). Dies könnte wiederum die Polarisationssignale während der T-Zell-Aktivierung beeinflussen. Um diese möglichen indirekten Auswirkungen von IL4-aNPs auf T-Zellen zu untersuchen, wurden allogene naive T-Zellen in Gegenwart von IL4-trainierten Makrophagen kultiviert. In diesem Modell führt die Fehlpaarung menschlicher Leukozyten-Antigene zu einer Antigen-unspezifischen T-Zell-Aktivierung und -Polarisierung. Es wurden keine signifikanten Unterschiede in der Häufigkeit der T-Zell-Subtypen Th1 (CD4+ IFNγhigh), Th2 (CD4+ IL4+), Treg-Zellen (CD4+ IL10+), Th17 (CD4+ IL17+) und zytotoxischer T-Zellen (CD8+ Granzyme B+ Perforin+) zwischen trainierten Makrophagen beobachtet und Kontrollen (Extended Data Abb. 6d). Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass das IL4-Training nicht die Fähigkeit zeigt, T-Zell-Reaktionen indirekt zu verzerren, was auf einen vorwiegend myeloidspezifischen Effekt schließen lässt.

a, Schematischer Überblick über die direkten Entzündungs- und trainierten Immunitätsexperimente in vitro. B. TNF- und IL6-Spiegel nach 24-stündiger Stimulation von Monozyten in Gegenwart von IL4-aNPs. c, TNF- und IL6-Spiegel nach erneuter Stimulation von IL4(-aNP)-trainierten Zellen. d, Schematischer Überblick über das in vivo-Toleranzmodell der Maus, einschließlich IL4-Nanotherapie. e, Serum-TNF- und IL6-Spiegel nach erneuter LPS-Exposition von Mäusen, die mit IL4m-aNPs behandelt wurden. Für statistische Vergleiche wurde der Mann-Whitney-U-Test verwendet. f, Schematischer Überblick über das menschliche experimentelle Endotoxämiemodell, einschließlich Ex-vivo-Toleranzumkehr. g, TNF- und IL6-Spiegel nach Ex-vivo-Restimulation menschlicher in vivo LPS-verträglicher Zellen. h, TNF- und IL6-facher Anstieg nach ex vivo-Restimulation menschlicher in vivo LPS-verträglicher Zellen. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt

Bei Patienten mit Sepsis können sowohl hyperinflammatorische Reaktionen als auch eine Immunparalyse auftreten, was ein therapeutisches Paradoxon darstellt. Die Induktion einer trainierten Immunität kann theoretisch dazu genutzt werden, die Immuntoleranz umzukehren, dies wurde jedoch nicht auf In-vivo-Modelle übertragen11. Ein Grund dafür ist, dass menschliches IL4 bei Mäusen keine biologische Aktivität zeigt. Wir haben daher ein chimäres Fusionsprotein bestehend aus menschlichem ApoA1 und murinem IL4 zur Formulierung mit Lipiden entworfen und hergestellt, um IL4m-aNPs zu erhalten. Hier untersuchten wir, ob IL4m-aNPs die LPS-induzierte Toleranz bei Mäusen umkehren können. Zu diesem Zweck injizierten wir C57B/6-Mäusen intraperitoneal LPS (0,1 mg kg−1), um eine Immunparalyse oder PBS (als Kontrolle) auszulösen. Wir verabreichten IL4m-aNPs (200 µg pro Dosis) 24 und 48 Stunden nach der LPS-Behandlung intravenös. Wir haben die Mäuse 72 Stunden nach der ersten Belastung erneut einer intraperitonealen Injektion von LPS (0,1 mg kg−1) ausgesetzt (Abb. 6d). Trotz der Einschränkungen in der Effektgröße verbesserte die Behandlung mit IL4m-aNPs die angeborenen Immunantworten, was durch statistisch signifikant (P = 0,0079) erhöhte IL6-Serumkonzentrationen nach erneuter LPS-Exposition tolerisierter Mäuse angezeigt wurde (Abb. 6e). Während die TNF-Konzentrationen bei einigen Mäusen ebenfalls deutlich erhöht waren, wurde aufgrund der Heterogenität der therapeutischen Reaktion keine statistische Signifikanz erreicht (P = 0,1508) (Abb. 6e). Insgesamt zeigen unsere In-vitro- und In-vivo-Daten, dass IL4-aNP-Immuntherapeutika die Toleranz verringern können.

Nachdem wir im Mausmodell eine Toleranzumkehr beobachtet hatten, untermauerten wir diese Ergebnisse mit einem Modell, das die klinische Immunparalyse beim Menschen besser nachahmt. Wir haben Blut von gesunden Personen erhalten, die sich einer experimentellen menschlichen Endotoxämie unterzogen, einem standardisierten kontrollierten Modell systemischer Entzündungen, das Merkmale sowohl hyperinflammatorischer als auch immunparalytischer Sepsis-Phänotypen erfasst (Abb. 6f). In diesem kontrollierten Humanmodell wird LPS intravenös an gesunde Probanden verabreicht, was zu einer systemischen Entzündungsreaktion führt, der eine Toleranzisierung zirkulierender Monozyten folgt, ein Phänomen, das auch bei sepsisinduzierter Immunparalyse beobachtet wird. Vor und 4 Stunden nach Beginn der LPS-Verabreichung wurde Blut gesammelt. Nach LPS-Verabreichung isolierte Monozyten zeigten bei sofortiger erneuter Exposition gegenüber LPS eine mangelhafte Zytokinproduktion, was auf eine Toleranz hindeutet (Extended Data Abb. 6b). Wenn die toleranten Monozyten der LPS-belasteten Freiwilligen 24 Stunden lang ex vivo entweder IL4 oder IL4-aNPs ausgesetzt wurden, zeigten sie nach erneuter Stimulation mit LPS am dritten Tag eine signifikant verbesserte Produktion von TNF, jedoch nicht von IL6 (Abb. 6g). (Konzentration) und 6h (Fachänderung) und erweiterte Daten Abb. 6c). Im Gegensatz dazu blieben unbehandelte Monozyten völlig tolerant. Zusammengenommen unterstreichen diese Daten die Fähigkeit von IL4 und IL4-aNPs, die LPS-Toleranz ex vivo zumindest teilweise umzukehren.

IL4 gilt allgemein als entzündungshemmendes Zytokin, seine langfristigen Auswirkungen auf die Monozyten- und Makrophagenfunktion sind jedoch unklar15,24,25,26. Wir gingen zunächst davon aus, dass IL4 die trainierte Immunität hemmen würde, ähnlich wie IL37 und IL38 (Ref. 27,28). Zusätzlich zu seinen bekannten hemmenden Wirkungen auf akute Entzündungen beobachteten wir, dass IL4 die trainierte Immunität induziert, was durch eine erhöhte Reaktionsfähigkeit der Zytokinproduktion beurteilt wurde. Während die Da die Induktion der trainierten Immunität durch IL4 unerwartet war, stimmen unsere Beobachtungen mit der Aktivierung der mTOR-Signalkaskade durch IL4 überein, einem zentralen Mechanismus der trainierten Immunität. 10,29. Anschließend untersuchten wir die Langzeitwirkung von IL4 vor der Exposition sowie die Fähigkeit von IL4, die durch experimentelle Endotoxämie induzierte Immuntoleranz umzukehren. In diesem Zusammenhang zeigen die Ergebnisse, dass ein entzündungshemmendes STAT6-abhängiges zelluläres Programm während der akuten Exposition von Zellen gegenüber IL4 dominiert, dass sich dieses jedoch mit der Zeit in Richtung eines mTOR-gesteuerten Programms verschiebt Programm der langfristig trainierten Immunität. Das IL4-Training zeigt Merkmale, die typischerweise der trainierten Immunität zugeschrieben werden, einschließlich einer erhöhten Zytokinproduktion, epigenetischer Neuverdrahtung, erhöhter Stoffwechselaktivität und veränderter transkriptomischer Reaktionen bei erneuter Stimulation. Diese Beobachtungen stehen im Einklang mit den zunehmenden Belegen für ein dynamisches und zeitabhängiges Modell der Monozytendifferenzierung, wie es in Lit. vorgeschlagen wird. 30.

Die Fähigkeit von IL4, gleichzeitig akute Entzündungen zu unterdrücken und gleichzeitig ein trainiertes Immunitätsprogramm zu induzieren, von dem berichtet wurde, dass es die Wirtsabwehr verbessert10, kann potenziell zur Behandlung schwerer Infektionen genutzt werden. Beispielsweise sind sowohl Sepsis als auch die Coronavirus-Krankheit 2019 (Lit. 31) durch eine fehlregulierte Immunantwort gekennzeichnet, was ein therapeutisches Paradoxon schafft, das sowohl die Bewältigung hyperinflammatorischer Reaktionen als auch die Verbesserung der Abwehrreaktionen des Wirts gegen (opportunistische) Sekundärinfektionen erfordert. Um diese Eigenschaften von IL4 zu nutzen, haben wir eine Strategie zur Proteinentwicklung von Nanopartikeln entwickelt und so die ungünstigen pharmakokinetischen Eigenschaften dieses Zytokins in vivo überwunden. Daher tauschen wir die verringerte IL4-Wirksamkeit des Fusionsproteins, eine Eigenschaft, die in zukünftigen Studien durch die Optimierung des Proteins und des Expressionssystems verbessert werden kann, wie wir es beim chimären Fusionsprotein getan haben, zugunsten der wesentlich verbesserten Bioverfügbarkeit und Pharmakokinetik aus. Wir zeigen, dass die aNP-Strategie die Bluthalbwertszeit und das Bioverteilungsprofil von IL4 günstig verändert, was zu einer erhöhten neutrophilenspezifischen und monozytenspezifischen Akkumulation in myeloischen zellreichen Organen wie dem Knochenmark und der Milz führt, wie bereits in Modellen beobachtet der trainierten Immunität32. Darüber hinaus haben diese Studien gezeigt, dass aNPs, die aus 1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DMPC), Cholesterin und ApoA1 bestehen, keine trainierte Immunität induzieren, was unterstreicht, dass unsere Ergebnisse eng mit der biologischen Wirkung von IL4 zusammenhängen ( Ref. 33). Während wir die Bioverteilung von aNPs untersuchten, die menschliches ApoA1-IL4 enthalten, entwickelten wir zusätzlich die murine Variante IL4m-aNP, um die Wirksamkeit in vivo zu bewerten. Tatsächlich zeigen wir, dass IL4m-aNPs die Immunparalyse in einem LPS-induzierten Sepsis-Mausmodell teilweise rückgängig machen können. Obwohl die Daten wiederhergestellte angeborene Immunantworten mit einem erheblichen Anstieg der IL6-Produktion und einem klaren Trend zu erhöhten TNF-Konzentrationen im Serum von mit IL4m-aNP behandelten Mäusen zeigen, sind umfassende Studien zur Dosisfindung erforderlich, um das Potenzial zu erweitern der IL4-aNP-Therapie bei einer Reihe immunvermittelter Erkrankungen, die durch gleichzeitige Hyperentzündung und Immunparalyse gekennzeichnet sind. Es ist ermutigend, dass wir mithilfe des menschlichen Fusionsproteins gezeigt haben, dass IL4-aNPs die Immuntoleranz von Zellen umkehren können, die aus einem menschlichen Modell gewonnen wurden, das eine klinische Immunparalyse nachahmt.

Wir gehen davon aus, dass die Zytokin-Nanopartikel-Technologie auch in anderen myeloischen Anwendungen Anwendung finden könnte. Der Zustand der Immunparalyse tritt nicht nur bei Sepsis auf. Immunonkologische Anwendungen könnten in Betracht gezogen werden, da Krebs auch durch eine lokale protumorale Entzündung und die gleichzeitige Unterdrückung von Antitumorreaktionen (häufig vermittelt durch myeloische Zellen) gekennzeichnet ist34. Myokardinfarkt und Schlaganfall sind ebenfalls durch eine sterile Entzündung gefolgt von einer Immunparalyse gekennzeichnet35,36, und Patienten mit schwerem Trauma leiden unter einer ähnlichen immunparalytischen Erkrankung37. In all diesen Situationen können die Reduzierung von Entzündungen und die Überwindung der Immunparalyse für die Genesung des Patienten und die Vorbeugung von Sekundärinfektionen von Vorteil sein. Die IL4-aNP-Technologie könnte zu einer therapeutischen Modalität für die Behandlung all dieser Erkrankungen entwickelt werden.

Buffy Coats- (Sanquin) oder EDTA-Vollblut von gesunden Freiwilligen wurde nach Einholung einer schriftlichen Einverständniserklärung entnommen. Das Material wurde mindestens 1:1 mit kalzium- und Magnesium-freiem PBS (Lonza) verdünnt und auf Ficoll-Paque (GE Healthcare) geschichtet. Eine 30-minütige Dichtegradientenzentrifugation bei 615 g wurde verwendet, um die Interphase der mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMC) abzutrennen. Nach drei bis fünf Wäschen mit kaltem PBS wurden PBMC-Ausbeute und -Zusammensetzung mit einem Hämoanalysegerät (XN-450; Sysmex) bewertet.

Negativ selektierte Monozyten wurden unter Verwendung von MACS gemäß den Anweisungen des Herstellers gewonnen (MACS Pan Monozyten-Isolationskit, Mensch; Miltenyi Biotec). Die Monozytenausbeute und -reinheit wurde mit einem Sysmex-Hämoanalysegerät bewertet.

Für einige Experimente (im Text angegeben) wurden Monozyten alternativ aus PBMCs durch hyperosmotische Dichtegradientenzentrifugation über Percoll (Sigma-Aldrich) angereichert. Etwa 150–200 × 106 PBMCs wurden auf eine hyperosmotische Percoll-Lösung (48,5 % v/v Percoll, 0,16 M NaCl, in sterilem Wasser) geschichtet und 15 Minuten lang bei 580 g und Raumtemperatur (RT) zentrifugiert. Die Interphase wurde gesammelt, einmal mit kaltem PBS gewaschen und in RPMI resuspendiert.

Alle primären menschlichen Monozyten und Makrophagen wurden in RPMI-1640 mit niederländischen Modifikationen (Invitrogen) kultiviert, das zusätzlich mit GlutaMAX (2 mM; GIBCO), Natriumpyruvat (1 mM; GIBCO) und Gentamicin (50 μg ml–1; Centrafarm) ergänzt wurde. . Dieses Medium wird im Weiteren als RPMI+++ bezeichnet. Darüber hinaus wurden dem Medium während der Zellkultur 10 % (v/v) gepooltes Humanserum zugesetzt (auch als „Zellkulturmedium“ bezeichnet).

Um eine trainierte Immunität in primären menschlichen Monozyten zu induzieren, wurde eine zuvor optimierte und veröffentlichte Methode verwendet38,39. Kurz gesagt, Monozyten wurden 1 Stunde lang an einer Zellkulturplatte mit flachem Boden befestigt und mit warmem PBS gewaschen, um alle nicht anhaftenden Zellen und Zelltrümmer zu entfernen. Anschließend wurden sie 24 Stunden lang mit einem der in der Ergänzungstabelle 1 aufgeführten Reize oder nur mit Medium („ungeschulte“ Kontrolle) stimuliert („trainiert“).

Für pharmakologische Hemmungsexperimente wurden die Monozyten vor der Zugabe des Trainingsstimulus 1 Stunde lang mit einem der in der Ergänzungstabelle 2 beschriebenen Inhibitoren vorinkubiert.

Nach der ersten 24-stündigen Stimulation wurden die Zellen mit warmem PBS gewaschen und warmes Zellkulturmedium hinzugefügt. Anschließend ließ man die Monozyten fünf Tage lang ruhen und sich in Makrophagen differenzieren. Am 6. Tag wurde die Induktion der trainierten Immunität bewertet. Zu diesem Zweck wurden die Zellen typischerweise für weitere 24 Stunden mit LPS erneut stimuliert, um die Zytokinproduktion auszulösen. Die Überstände wurden gesammelt und bis zur weiteren Analyse bei –20 ° C gelagert.

Bei den meisten anderen trainierten Immunitätsauslesemethoden wurden die Zellen wie folgt gesammelt: Zunächst wurden die Zellen 30 Minuten lang in einem Zellkulturinkubator in Versene-Zelldissoziationsreagenz (Life Technologies) inkubiert. Anschließend wurden die Zellen mit einem Zellschaber von den Kulturplatten entfernt. Um die Ausbeute zu maximieren, wurden die Kulturplatten nach Zugabe von eiskaltem PBS ein zweites Mal abgekratzt. Die Makrophagen wurden 10 Minuten lang bei 300 g und 4 °C zentrifugiert und gezählt, bevor mit den nachgelagerten Anwendungen fortgefahren wurde.

Für Experimente, in denen moDCs mit Makrophagen (ungeschulte Kontrolle oder IL4-trainierte) verglichen wurden, wurden moDCs wie folgt differenziert. Zunächst wurden wie oben beschrieben negativ selektierte Monozyten gewonnen. Nach einstündiger Adhärenz und einem PBS-Waschvorgang wurden sie in RPMI+++ mit 10 % HPS kultiviert, zusätzlich ergänzt mit IL4 (25 ng ml–1) und GM-CSF (1.000 IU ml–1; Premiumqualität, Miltenyi Biotec). Die Zellen wurden bis zum 6. Tag differenziert, mit einer Auffrischung des Mediums am 3. Tag. Am 6. Tag wurden zusätzlich zu den adhärenten Zellen auch die nicht adhärenten Zellen gesammelt (wie oben beschrieben). Die moDCs und Makrophagen wurden dann wie unten beschrieben einer Analyse mittels Durchflusszytometrie unterzogen.

Acht gesunde (durch Anamnese, körperliche Untersuchung und routinemäßige Labortests bestätigte) männliche Freiwillige im Alter zwischen 18 und 35 Jahren erteilten eine schriftliche Einverständniserklärung zur Teilnahme an experimentellen Endotoxämie-Experimenten, die in der Forschungseinheit der Intensivstation des Radboud durchgeführt wurden Universitätsklinikum. Alle Studienverfahren wurden von der örtlichen Ethikkommission (CMO Arnhem-Nijmegen (Radboudumc), Registrierungsnummern NL71293.091.19 und 2019-5730) genehmigt und in Übereinstimmung mit der neuesten Version der Erklärung von Helsinki durchgeführt.

Es wurde ein kontinuierliches Endotoxin-Infusionsschema angewendet, wie es an anderer Stelle ausführlich beschrieben wird40. Kurz gesagt, die Teilnehmer wurden in die Forschungseinheit aufgenommen und eine Vena antecubitalis und eine Arteria radialis wurden mit einer Kanüle versehen, um die Verabreichung von Flüssigkeiten und Endotoxin sowie die Blutentnahme und hämodynamische Überwachung zu ermöglichen. Während des gesamten Experiments wurde kontinuierlich ein 3-Kanal-EKG aufgezeichnet. Nach isoosmolarer Vorhydratisierung (1,5 l NaCl 0,45 % und Glucose 2,5 %, intravenös verabreicht in der Stunde vor Beginn der Endotoxininfusion) wurden die Freiwilligen intravenös mit einer Initialdosis von 1 ng kg−1 Körpergewicht Endotoxin (Escherichia coli-Lipopolysaccharid) belastet (LPS) Typ O113, Chargennr. 94332B1; List Biological Laboratories), direkt gefolgt von einer kontinuierlichen Infusion von 0,5 ng kg−1 h−1 für 3 Stunden. Die Teilnehmer wurden nach der Endotoxin-Beladungsdosis 8 Stunden lang überwacht und anschließend aus der Forschungseinheit entlassen.

Für dieses Projekt wurden Blutproben zu zwei Zeitpunkten entnommen: 1 Stunde vor und 4 Stunden nach der Verabreichung der Aufsättigungsdosis. Negativ selektierte Monozyten wurden wie oben beschrieben erworben. Die Zellen wurden 24 Stunden lang mit rekombinantem humanem IL4, scheibenförmigen IL4-aNPs, LPS (zur Beurteilung der anfänglichen Immuntoleranz) oder nur Medium (als Kontrolle) aneinander gebunden und stimuliert. Nach einer PBS-Waschung wurden die Zellen 48 Stunden lang in Kulturmedium ruhen gelassen und weitere 24 Stunden lang mit LPS erneut stimuliert. Überstände wurden gesammelt und bei –20 ° C gelagert.

TNF, IL6 und IL1Ra wurden in Zellkulturüberständen mit duoset ELISA-Kits (R&D Systems) gemäß den Anweisungen des Herstellers gemessen. Für Laktatmessungen wurde ein fluorometrischer Test verwendet. Etwa 30 µl Probe, Mediumkontrolle oder bekannter Standard wurden in eine schwarze 96-Well-Platte gegeben. Dann wurden 30 µl Reaktionsmischung (PBS pH 7,4, Meerrettichperoxidase (0,2 U ml−1), Lactatoxidase (2 U ml−1), Amplex Red (100 µM; Fisher Scientific)) zugegeben und die Reaktionsmischung wurde hinzugefügt 20 Minuten im Dunkeln bei RT inkubiert. Unmittelbar danach wurde die Fluoreszenz bei 530/25 nm und 590/35 nm gemessen. Die Gen5-Software (v3.03, BioTek) wurde in Verbindung mit Microsoft Excel verwendet, um die Zytokin- und Laktatkonzentrationen in den Originalproben zu berechnen.

Makrophagen wurden wie oben beschrieben gesammelt und zur Färbung auf eine 96-Well-Platte mit V-Boden übertragen. Die Zellen wurden 5 Minuten lang bei 4 °C und 400 g zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt und die Zellen wurden einmal mit 200 µl PBA (PBS pH 7,4, 1 % w/v BSA (Sigma)) gewaschen.

Fc-Rezeptoren wurden durch 15-minütige Inkubation in PBS, ergänzt mit 10 % gepooltem Humanserum, bei 4 °C blockiert. Nach erneutem Waschen wurden Oberflächenmarker und Lebensfähigkeit in einem Volumen von 50 µl 30 Minuten lang bei 4 °C unter Verwendung der in der Ergänzungstabelle 3 beschriebenen Antikörper und Lebensfähigkeitsfarbstoffe gefärbt. Nach zwei Wäschen wurden die Zellen in 150 µl resuspendiert PBA und gemessen auf einem Cytoflex-Durchflusszytometer (Beckman Coulter) oder einem BD FACSVerse-System (BD Biosciences). Die Kompensation wurde mit VersaComp-Kompensationskügelchen (Beckman Coulter) für einzelne Antikörperfärbungen durchgeführt; Für Einzelfärbungen des Lebensfähigkeitsfarbstoffs wurde eine Mischung aus lebenden und durch Hitze abgetöteten Zellen verwendet (gemäß den Empfehlungen des Herstellers). Die Datenanalyse wurde in Flowjo (v10.7.1, BD Biosciences) durchgeführt. Unsere Gating-Strategie war wie folgt: Zuerst wurde bei Bedarf ein Zeit-Gate verwendet. Anschließend wurden einzelne Zellereignisse mithilfe nachfolgender FSC-A/SSC-A- und FSC-A/FSC-H-Gates ausgewählt. Abgestorbene Zellen wurden aus der Analyse entfernt, indem die Population mit negativem Lebensfähigkeitsfarbstoff ausgewählt wurde. Als Maß für die Expression von Oberflächenmarkern wurden geometrische mittlere Fluoreszenzintensitäten berechnet.

Für Experimente mit gemischten Lymphozytenreaktionen wurden gesammelte Makrophagen für nachfolgende T-Zell-Polarisationstests verwendet. Allogene naive T-Zellen wurden mit Makrophagen in einem Verhältnis von 10 T-Zellen pro Makrophage ausgesät. Die Zellen wurden in 96-Well-Platten mit flachem Boden 7 Tage lang in Standard-Zellkulturmedium kultiviert. In diesem Modell führt die Fehlpaarung menschlicher Leukozyten-Antigene zu einer unspezifischen Aktivierung des T-Zell-Rezeptors. Am letzten Tag wurden die Zellen mit Phorbol-12-Myristat-13-Acetat (25 ng ml-1) + Ionomycin (0,5 µg ml-1) für 4 Stunden in Gegenwart von 100 ng ml-1 Brefeldin A, einem Golgi-Stecker‘. Die Zellen wurden gesammelt und auf zwei Durchflusszytometrie-Antikörper-Panels aufgeteilt (eines für CD4-T-Zellen und eines für CD8; siehe auch Ergänzungstabelle 3). Die Zellen wurden auf ähnliche Weise wie oben beschrieben gefärbt, mit einem zusätzlichen Schritt zur Permeabilisierung der T-Zellen, um eine intrazelluläre Zytokinfärbung zu ermöglichen. Dies wurde unter Verwendung des Fix- und Perm-Puffersatzes (eBioscience) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Die Gating-Strategie ähnelte der oben beschriebenen, mit der Hinzufügung einer Auswahl für CD3-positive Ereignisse. Der Prozentsatz der Zellen, die positiv auf typische Zytokine der T-Zell-Polarisation sind, wurde berechnet, um die Anteile der T-Zell-Untergruppen abzuschätzen.

Monozyten wurden mit RPMI, IL4 oder unterschiedlichen Konzentrationen von IL4-aNPs (in den erweiterten Daten Abb. 6a angegeben) 20 Minuten lang bei 37 ° C stimuliert. Die Zellen wurden auf eine 96-Well-Platte mit V-Boden übertragen und für die Dauer des Färbevorgangs auf Eis gehalten. Nach der Färbung auf Lebensfähigkeit und CD14 (in der oben beschriebenen Weise) wurden die Zellen unter Verwendung des Fix- und Perm-Puffersatzes (eBioscience) 45 Minuten lang bei 4 ° C im Dunkeln fixiert und permeabilisiert. Die Zellen wurden zweimal mit Perm-Puffer gewaschen und über Nacht in gefriergekühltem absolutem Methanol bei –20 °C inkubiert. Nach zwei weiteren Wäschen in Perm-Puffer wurden die Zellen unter Verwendung des in der Ergänzungstabelle 3 beschriebenen Antikörpers 45 Minuten lang bei 4 ° C im Dunkeln auf Phospho-STAT6 gefärbt. Die Zellen wurden noch zweimal in Perm-Puffer gewaschen und schließlich zur Aufnahme auf dem Cytoflex-Zytometer in PBA resuspendiert. Die Gating-Strategie ähnelte weitgehend der für Makrophagen-Oberflächenmarker, fügte jedoch eine Selektion für CD14-positive Ereignisse hinzu.

Makrophagen wurden wie oben beschrieben gesammelt und 1 Stunde lang bei 37 °C mit FITC-markiertem C. albicans (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von M. Jaeger, Radboudumc) bei einer MOI von 1:5 inkubiert. Die Zellen wurden zweimal mit eiskaltem PBA gewaschen und auf Eis gehalten, um die Phagozytose zu stoppen. Die Zellen wurden 30 Minuten lang im Dunkeln bei 4 ° C auf CD45 (Ergänzungstabelle 3) gefärbt. Nach zwei Wäschen wurde Trypanblau bis zu einer Endkonzentration von 0,01 % zugesetzt, um extrazelluläres FITC-Candida abzuschrecken. Die Zellen wurden dann mit einem Cytoflex-Durchflusszytometer erfasst.

Während der Datenanalyse wurden zunächst CD45+-Ereignisse ausgewählt, um Nur-Candida-Ereignisse zu entfernen. Anschließend wurden einzelne Zellen wie oben beschrieben aktiviert und der Prozentsatz an Candida-FITC-positiven Makrophagen in jeder Probe berechnet.

Makrophagen wurden wie oben beschrieben gesammelt. Die Zellen wurden in RPMI+++ resuspendiert und in über Nacht kalibrierten Kartuschen mit 10 Zellen pro Vertiefung ausgesät. Nach einstündiger Anhaftung wurde das Medium gegen Testmedium (Agilent; siehe unten) ausgetauscht und die Zellen wurden 1 Stunde lang bei 37 °C und Umgebungs-CO2-Konzentrationen inkubiert. Die Sauerstoffverbrauchsraten und die extrazellulären Ansäuerungsraten wurden als Proxys für den glykolytischen und mitochondrialen Stoffwechsel mithilfe eines Seahorse XF Glycolysis Stress Test-Kits oder eines Seahorse XF Cell Mito Stress Test-Kits (beide Agilent; Messungen wurden gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt) gemessen.

Monozyten oder Makrophagen wurden in RLT-Puffer (Qiagen) lysiert und bei –80 ° C gelagert. RNA-Extraktionen wurden unter Verwendung von RNeasy-Minisäulen (Qiagen) mit DNAse-I-Behandlung auf der Säule (RNase-frei; Qiagen) durchgeführt. Vorläufige Qualitätskontrollen und Konzentrationsmessungen wurden mit einem Nanodrop-Gerät durchgeführt. Die Proben wurden zur RNA-Sequenzierung mithilfe der DNBseq-Plattform an das Beijing Genome Institute (BGI Dänemark) gesendet.

Um auf Genexpressionsniveaus zu schließen, wurden die RNA-Sequenzierungsablesungen mithilfe von Bowtie (v1.2)41 mit dem menschlichen hg19-Transkriptom abgeglichen. Die Quantifizierung der Genexpressionsniveaus als RPKM wurde mit MMSEQ (v1.0.10)42 durchgeführt. Lesevorgänge und Transkripte wurden mit DEseq2 normalisiert und paarweise Vergleiche durchgeführt. Differenziell exprimierte Gene wurden mithilfe von DEseq2 (v1.34.0) mit Fold Change >2 und P <0,05 identifiziert, mit einem mittleren RPKM >1 (Lit. 43). Um Gene zu identifizieren, die durch IL4-Training hochreguliert oder abgeschwächt wurden, wurden RPMI-d6- und IL4-d6-Makrophagen mit RPMI-d6+LPS- bzw. IL4-d6+LPS-Proben verglichen. Die Genlisten wurden zusammengeführt und auf der Grundlage von IL4-d6+LPS/RPMI-d6+LPS eingestuft. Die Genontologie und TF-Motivanalyse wurde an Genpromotoren mit dem HOMER findMotifs-Tool (v4.11)44 durchgeführt.

Makrophagen wurden wie oben beschrieben gesammelt und in RPMI+++ resuspendiert. Die Zellen wurden 10 Minuten lang in 1 % methanolfreiem Formaldehyd fixiert. Die Reaktion wurde dann für 3 Minuten durch Zugabe von 125 mM Glycin gestoppt. Die fixierten Zellen wurden dreimal mit eiskaltem PBS gewaschen, mit etwa 15 × 106 Zellen pro ml in Lysepuffer (20 mM HEPES pH 7,6, 1 % SDS, 1 × Proteaseinhibitor-Cocktail (Roche)) lysiert und mit Ultraschall behandelt (Bioruptor Pico). , Diagenode) und zentrifugiert (10 min, 16.060 g, bei RT).

Aliquots von Chromatin wurden in 0,5 × TBE-Puffer (ergänzt mit 0,5 mg ml-1 Proteinase K (Qiagen)) 1 Stunde lang bei 65 °C entvernetzt und auf einem 1 %igen Agarosegel laufen gelassen, um die Zielfragmentgröße von 200–800 zu bestätigen bp.

Das verbleibende Chromatin wurde in ChIP- und Eingabeproben aufgeteilt. ChIP-Proben wurden 10x in Verdünnungspuffer verdünnt (16,7 mM Tris pH 8,0, 1,0 % Triton, 1,2 mM EDTA, 167 mM NaCl, 1x Proteaseinhibitor-Cocktail in Milli-Q) und 1 µg Antikörper in ChIP-Qualität (Diagenode). wurde hinzugefügt. Die Proben wurden über Nacht bei 4 °C rotiert.

Magnetische Protein-A/G-Kügelchen (Dynabeads) wurden zweimal in Verdünnungspuffer, ergänzt mit 0,15 % SDS und 0,1 % BSA, gewaschen. Die gewaschenen Perlen wurden zu den ChIP-Proben gegeben und 1 Stunde lang bei 4 °C rotiert. Das perlengebundene Chromatin wurde anschließend wie folgt gewaschen (Rotation für 5 Minuten, 4 °C): einmal mit salzarmem Waschpuffer (20 mM Tris pH 8,0, 1,0 % Triton, 0,1 % SDS, 2 mM EDTA, 150 mM NaCl). in Milli-Q), zweimal mit Waschpuffer mit hohem Salzgehalt (wie Waschpuffer mit niedrigem Salzgehalt, aber mit 500 mM NaCl) und zweimal mit Waschpuffer ohne Salz (20 mM Tris pH 8,0, 1 mM EDTA, in Milli). -Q). Chromatin wurde 20 Minuten lang bei RT in Elutionspuffer (0,1 M NaHCO3, 1 % SDS, in Milli-Q) von den Perlen eluiert. Eingangsproben wurden 12-fach in Elutionspuffer verdünnt. Nach Zugabe von NaCl (0,2 M) und Proteinase K (0,1 mg ml−1) wurden alle Proben für mindestens 4 Stunden auf einem Schüttelheizblock (65 °C, 1.000 U/min) entvernetzt. Zur Reinigung von DNA-Fragmenten wurden MinElute PCR-Reinigungssäulen (Qiagen) verwendet. DNA-Fragmente wurden bis zur anschließenden Analyse mittels qPCR bei 4 °C gelagert.

Die qPCR-Analyse für ChIP-Proben und -Eingaben wurde wie folgt durchgeführt. Die SYBR-Green-Methode wurde verwendet, um qPCR mit den in der Ergänzungstabelle 4 aufgeführten Primern durchzuführen. Eine vergleichende Ct-Methode wurde verwendet, um ChIP mit Eingabeproben zu vergleichen und die relative Häufigkeit über einer negativen Kontrollregion zu berechnen. GAPDH und die nicht translatierte Region von ZNF wurden jeweils als Negativ- und Positivkontrolle für H3K9me3 verwendet. TNF wurde unter Verwendung von sechs Primerpaaren für die AUC-Analyse wie zuvor beschrieben abgefragt45.

ClearColi BL21 (DE3) (Lucigen) wurden mit einem pET20b(+)apoA1–IL4-Expressionsvektor transformiert. Transformierte Bakterien wurden in 40 ml Lysogenie-Brühe (Sigma-Aldrich), ergänzt mit 100 μg l-1 Ampicillin, inokuliert und über Nacht bei 37 ° C gezüchtet. Anschließend wurde die Übernachtkultur in 2YT-Medium (16 g l-1 Pepton, 10 g l-1 Hefeextrakt und 10 g l-1 NaCl), ergänzt mit 100 µg l-1 Ampicillin, beimpft und bei 37 °C gezüchtet. An dem Punkt, an dem die Absorption bei 600 nm >1,5 erreichte, wurde 1,0 mM Isopropyl-β-d-thiogalacopyranosid zugegeben, um die Expression von pET20b(+)apoA1–IL4 zu induzieren, und die Zellen wurden über Nacht bei 20 °C inkubiert. Die Zellen wurden vor der Herstellung der Lysate und der Reinigung durch Zentrifugation gesammelt.

ApoA1-IL4-Fusionsprotein exprimierende ClearColi-Zellen wurden durch 10-minütige Zentrifugation bei 10.880 g und 4 ° C gesammelt. Die gesammelten Zellen wurden in PBS resuspendiert und 15 Minuten lang bei 3.500 g und 4 ° C zentrifugiert. Die Zellen wurden unter Verwendung von 20 ml BugBuster-Proteinextraktionsreagenz (Merck) und 20 µl Benzonase-Nuklease (Merck) pro Liter Kultur auf einem Schüttler 30 Minuten lang bei RT lysiert. Zelllysate wurden 30 Minuten lang bei 39.000 g und 4 ° C zentrifugiert. Unlösliche Pellets wurden mit 10 ml BugBuster pro Liter gewaschen und 20 Minuten bei 39.000 g und 4 °C zentrifugiert. Pellets mit Einschlusskörpern wurden in Extraktionspuffer (6 M Guanidinhydrochlorid, 50 mM Kaliumphosphat und 1 mM reduziertes Glutathion) resuspendiert und 15 Minuten lang bei RT auf einem Schüttler inkubiert. Die Suspension wurde 30 Minuten lang bei 39.000 g und 4 °C zentrifugiert, um unlösliche Anteile zu entfernen. Die gefilterte lösliche Fraktion wurde auf eine Nickelsäule geladen und mit 15 Säulenvolumina IMAC-Waschpuffer gewaschen. ApoA1–IL4 wurde auf der Nickelsäule unter Verwendung eines Entfaltungspuffers mit linearem Gradienten von 60 ml (7 M Harnstoff, 1 mM reduziertes Glutathion, 0,1 mM oxidiertes Glutathion, 50 mM Kaliumphosphat und 100 mM NaCl, pH 6,8) bis zu 60 ml Rückfaltungspuffer entfaltet und erneut gefaltet (1 mM reduziertes Glutathion, 0,1 mM oxidiertes Glutathion, 50 mM Kaliumphosphat und 100 mM NaCl pH 6,8) bei 2,5 ml min−1. Rückgefaltetes ApoA1–IL4 wurde mit 0,5 M Imidazol, 20 mM Tris und 0,5 M NaCl bei pH 7,9 von der Säule eluiert. Das Eluat wurde gesammelt, konzentriert und mittels Größenausschlusschromatographie (HiLoad 16/600 Superdex 75 Erhöhung; GE Healthcare), äquilibriert mit PBS-Lagerpuffer, weiter gereinigt und gepuffert. Die Fraktionen wurden mittels SDS-PAGE analysiert, gepoolt, konzentriert und in flüssigem Stickstoff eingefroren, bevor sie bei –80 °C gelagert wurden. Die ApoA1-IL4-Masse wurde durch Q-ToF LC-MS (WatersMassLynx v4.1) unter Verwendung von MagTran V1.03 für MS bestätigt.

HEK293T-Zellen wurden mit fuGENE (Promega) co-transfiziert, einschließlich des Transfervektors pHR-apoA1–IL4m, der Verpackung von pCMVR8.74 und der Umhüllung von pMD2.G in Opti-MEM (GIBCO) bei 37 ° C für 24 Stunden. Die Zellen wurden mit DMEM, ergänzt mit 2 % hitzeinaktiviertem FBS, gewaschen und 48 Stunden lang inkubiert. Um das Lentivirus mit pHR-apoA1–IL4m zu erhalten, wurde der Überstand bei 875 g zentrifugiert, um Zelltrümmer zu entfernen, durch einen 0,45-µm-PES-Spritzenfilter filtriert und 2 Stunden lang bei 4 °C und 50.000 g zentrifugiert. Das pHR-apoA1–IL4m-Lentivirus enthaltende Pellet wurde in Kulturmedium resuspendiert, in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei –80 °C sortiert. HEK293F-Zellen wurden mit pHR-apoA1–IL4m, das Lentivirus enthielt, in Transfektionsmedium (DMEM, 10 % HI FBS, 1 × Polybrene (Sigma-Aldrich)) für 24 Stunden transduziert. Anschließend wurden die Zellen in Expressionsmedium (50 % EX-CELL 293) kultiviert Serumfreies Medium für HEK293-Zellen (Merck) und 50 % FreeStyle 293-Expressionsmedium (Thermo Fisher Scientific), ergänzt mit Glutamax, 1 % Pen-Strep und 1 µg ml−1 Doxycyclin (Merck), auf einem Schüttler bei 150 U/min für 3 Tage bei 37 °C. Der Kulturüberstand, der ApoA1–IL4m enthielt, wurde 15 Minuten lang bei 3.500 g und 4 °C zentrifugiert und durch einen 0,22-µm-PES-Spritzenfilter filtriert, um Zelltrümmer zu entfernen. Die gefilterte lösliche Fraktion wurde auf eine StrepTactin XT 4flow 5-ml-Säule geladen (Cytiva) und mit 5 Säulenvolumina W-Puffer (150 mM NaCl, 100 mM Tris, 1 mM EDTA pH 8) mit einer Flussrate von 1–2 ml min−1 gewaschen. ApoA1–IL4m wurde mit W-Puffer von der Säule eluiert ergänzt mit 50 mM Biotin. Das Eluat wurde gesammelt, konzentriert und in flüssigem Stickstoff eingefroren, bevor es bei –80 °C gelagert wurde. Die ApoA1–IL4m-Masse wurde durch Q-ToF LC-MS (WatersMassLynx v4.1) unter Verwendung von MagTran V1 bestätigt. 03 für MS.

Um die Fusion von ApoA1 und IL4 zu bestätigen, wurden 100 ng IL4 (BioLegend), ApoA1 und ApoA1–IL4 auf ein 4–20 %iges Polyacrylamidgel (Bio-Rad) geladen. Nach der Gelelektrophorese wurden die Proben mit Blotpuffer (10 × TG-Puffer, 20 % Methanol) auf Nitrozellulosemembranen übertragen. Anschließend wurden die Membranen über Nacht bei 4 °C mit Blockierungspuffer (5 % Milch, 0,1 % Tween in PBS (PBST)) inkubiert. Die Blots wurden mit primären monoklonalen Antikörpern monoklonalem Anti-IL4 (HIL41, 1:200; sc-12723, Santa Cruz Biotechnology) und Anti-ApoA1 (B10, 1:100; sc-376818, Santa Cruz Biotechnology) 1 Stunde lang inkubiert 4 °C. Nach der Inkubation mit Primärantikörpern wurden die Membranen gewaschen und mit Kaninchen-Anti-Maus-IgG (H+L)-HRP-Konjugat (1:5.000, 31457, Pierce) inkubiert. HRP-konjugierte Sekundärantikörper wurden mit TMB (Thermo Fisher Scientific) nachgewiesen und mit dem Image Quant Gel Imager (GE Healthcare) sichtbar gemacht.

SPR-Messungen wurden mit einem Biacore ×100 SPR-System (GE Healthcare) durchgeführt. Die menschliche IL4-Rezeptor-Alpha-FC-Chimäre (Biolegend) wurde auf einem Protein-G-Sensorchip (GE Healthcare) immobilisiert. Die Log2-Verdünnungskonzentrationsreihe bestand aus ApoA1–IL4 im Bereich von 200 nM bis 6,25 nM und aus menschlichem IL4 im Bereich von 20 nM bis 0,65 nM. Alle Proben wurden in HPS-EP-Puffer (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0,005 % (v/v) P20, pH 7,4) hergestellt. Die Assoziation wurde 180 s lang und die Dissoziation 180 s lang mit einer Flussrate von 30 μl min−1 überwacht. Der Sensorchip wurde mit Glycin 1,5 (10 mM Glycin-HCl pH 1,5, GE Healthcare) regeneriert. Die Kinetik wurde durch Anpassen der Interaktions-SPR-Daten für eine 1:1-Bindung bestimmt.

HEK-Blue IL4/IL13-Zellen wurden von InvivoGen bezogen. Diese Zelllinie verfügt über einen vollständig aktiven STAT6-Signalweg und trägt ein STAT6-induzierbares SEAP-Reportergen. Die HEK-Blue IL4/IL13-Zellen produzieren SEAP als Reaktion auf IL4 und IL13. Die Menge an sezerniertem SEAP kann mit QUANTI-Blue (InvivoGen) bestimmt werden. Etwa 180 μl DMEM mit 10 % FBS und 1 % Pen-Strep, enthaltend 5 × 104 Zellen, wurden pro Vertiefung in eine Platte mit 96 Vertiefungen gegeben. Anschließend wurden 20 μl Stimulus oder Vehikel zugegeben und die Zellen 20–24 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurden 180 μl QUANTI-Blue pro Well in eine separate 96-Well-Platte (Flachboden) gegeben und 20 μl des Zellüberstands hinzugefügt. Die Platte wurde 1–3 Stunden lang bei 37 °C inkubiert und die Absorption bei 640 nm wurde auf einem Tecan Spark-Plattenlesegerät gemessen, um die SEAP-Werte zu bestimmen.

Alle Phospholipide wurden von Avanti Polar Lipids bezogen. Es wurden vier verschiedene aNPs formuliert. Für scheibenförmige aNPs aus Stammlösungen (10 mg ml−1) in Chloroform, DMPC (133,5 μl) und Cholesterin (Sigma-Aldrich) (7,5 μl) und für sphärische aNPs POPC (66,5 μl), PHPC (17,5 μl), Cholesterin (4,5 μl) und Tricaprylin (Sigma-Aldrich) (2,79 μl aus 0,956 g ml–1 Stammlösung) wurden in einem Glasfläschchen vereint und unter Vakuum getrocknet. Der resultierende Film wurde in einer Mischung aus Acetonitril und Methanol (95:5 %, 800 μl Gesamtvolumen) erneut aufgelöst. Für die auf ApoA1 basierende Formulierung wurde Cholesterin (15 μl) verwendet. Separat eine Lösung von ApoA1-Protein in PBS (6 ml, 0,1 mg ml−1), ApoA1–IL4-Protein in PBS (6 ml, 0,17 mg ml−1) oder ApoA1–IL4m in PBS (6 ml, 0,18 mg ml−1). 1) wurde vorbereitet.

Beide Lösungen wurden gleichzeitig mit einer mikrofluidischen Pumpe Fusion 100 (Chemyx) in einen Zeonor-Fischgrätenmischer (Microfluidic Chipshop, Produktcode 10000076) mit einer Durchflussrate von 0,75 ml min−1 für die Lipidlösung und einer Rate von 6 ml min−1 injiziert für die ApoA1-Lösung. Die erhaltene Lösung wurde durch Zentrifugalfiltration unter Verwendung eines Vivaspin-Röhrchens mit einem MWCO von 10 kDa für scheibenförmige und einem MWCO von 100 kDa für sphärische aNPs bei 3.500 g konzentriert, um ein Volumen von 1 ml zu erhalten. PBS (5 ml) wurde zugegeben und die Lösung auf 5 ml konzentriert; dies wurde zweimal wiederholt. Die gewaschene Lösung wurde auf etwa 1,5 ml konzentriert und durch einen 0,22 μm PES-Spritzenfilter filtriert, um die fertigen aNPs zu erhalten. Die Proteinkonzentration in aNP-Proben wurde mit dem Pierce BCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher Scientific) quantifiziert. Um fluoreszierende aNPs zu formulieren, wurden 0,5 mg DiOC18(3)-Farbstoff (DiO) (Thermo Fisher Scientific) in der Chloroformlösung gelöst, die zur Herstellung des Lipidfilms verwendet wurde.

Die erhaltenen aNP-Formulierungen in PBS wurden durch einen 0,22 µm PES-Spritzenfilter filtriert und durch DLS auf einem Malvern Zetasizer Nano ZS-Analysegerät analysiert. Die Werte werden als mittlere zahlenmittlere Größenverteilung angegeben.

IL4, apoA1–IL4 und IL4-aNPs wurden mit zwei molaren Überschüssen an DFO-p-NCS (5 mg ml−1 in DMSO) 2 Stunden lang inkubiert und dreimal mit einem 10 kDa MWCO Vivaspin-Röhrchen gewaschen, um nicht umgesetztes DFO-p zu entfernen -NCS. Zur Radiomarkierung wurden DFO-gekoppelte Proteine ​​und aNPs mit 89Zr bei 37 °C unter Verwendung eines Thermomixers bei 600 U/min 1 Stunde lang inkubiert und dreimal mit 10 kDa MWCO Vivaspin-Röhrchen gewaschen, um nicht umgesetztes 89Zr zu entfernen.

Zunächst wurde die Oberfläche von 200-Mesh-Lacey-Kohlenstoff-gestützten Kupfergittern (Electron Microscopy Sciences) 40 Sekunden lang mit einem Cressington 208-Kohlenstoffbeschichter plasmabehandelt. Anschließend wurden 3 ml der IL4-aNPs-Probe (~1 mg Protein pro ml) auf ein Gitter aufgetragen und durch Tauchvitrifizierung in flüssigem Ethan unter Verwendung eines automatisierten Roboters (FEI Vitrobot Mark IV) zu einem dünnen Film verglast. Die Kryo-TEM-Bildgebung wurde mit dem cryoTITAN (Thermo Fisher Scientific) durchgeführt, der mit einer Feldemissionskanone, einem Gatan-Bildgebungsfilter nach der Säule (Modell 2002) und einer 2k × 2k Gatan-CCD-Kamera nach dem GIF (Modell 794) ausgestattet war Die Bilder wurden bei einer Beschleunigungsspannung von 300 kV im Hellfeld-TEM-Modus mit verlustfreier Energiefilterung bei entweder 6.500-facher (Dosisleistung von 1,64 Elektronen A−2 s−1) oder 24.000-facher Vergrößerung (Dosisleistung von 11,8 Elektronen A−2) aufgenommen s−1) und 1 s Erfassungszeit.

Menschliche Monozyten wurden wie oben beschrieben aus dem peripheren Blut eines gesunden Spenders isoliert. Etwa 100.000 Monozyten wurden pro Vertiefung auf ein mit Zellkultur behandeltes Kammerdeckglas (µ-Slide 8-well, IBID) ausgesät. Nach 2-stündiger Inkubation bei 37 °C (Zellanheftung) wurden die Zellen 2 Stunden bei 37 °C mit Cy5-markierten Varianten von entweder nacktem ApoA1 oder ApoA1-IL4, scheibenförmigen aNPs oder IL4-aNPs und kugelförmigen aNPs oder inkubiert IL4-aNPs. Anschließend wurden die Zellen mit PBS gewaschen und 20 Minuten mit 4 % PFA fixiert. Der IL4-Rezeptor wurde mit einem polyklonalen Kaninchen-IgG1-Anti-Human-IL4R-Primärantikörper (Thermo Fisher Scientific; 1:100-Verdünnung) 24 Stunden lang bei 4 °C gefärbt, gefolgt von einem Ziegen-Anti-Kaninchen-Alexa-Fluor-488-konjugierten Sekundärantikörper (Thermo Fischer). Wissenschaftlich; Verdünnung 1:500) für 1 Stunde bei Raumtemperatur. Die gefärbten Zellen wurden in PBS bei 4 °C gelagert. Für das dSTORM wurden die Zellen vor und während der Bildgebung einige Minuten lang in GLOXY-Bildgebungspuffer (40 μg ml-1 Katalase, 0,5 mg ml-1 Glucoseoxidase, 5 % Glucose und 0,01 M Cysteamin in PBS, pH 8,0) getaucht . Die Aufnahme wurde im Total-Internal-Reflection-Fluoreszenzmodus mit ONI Nanoimager (ONI) durchgeführt. Es ist mit einem 100×/1,4NA Ölimmersionsobjektiv und einer sCMOS-Kamera ausgestattet und in dieser Studie wurden 488 nm (200 mW) und 640 nm (1000 mW) Laser verwendet. Mit einer Belichtungszeit von 10 ms und einem Sichtfeld von 50 × 80 µm wurden etwa 10.000 Bilder aufgenommen. Die Rohdaten wurden mit der ThunderSTORM-Software (v1.3)46,47 verarbeitet und ergaben Bilder mit einer räumlichen Auflösung von 10 nm.

Weibliche C57BL/6 J-Mäuse (ca. 8–11 Wochen alt und ca. 20 g) wurden von Charles River Deutschland gekauft. Für nichtmenschliche Primatenstudien wurden zwei männliche Javaneraffen (Macaca fascicularis) im Alter von 15 und 16 Jahren verwendet. Alle Tiere wurden unter klimatisierten Bedingungen bei 20–24 °C, 45–65 % Luftfeuchtigkeit mit 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklen gehalten und mit Wasser nach Belieben versorgt. Mäuse erhielten eine Standard-Chow-Diät und nichtmenschliche Primaten erhielten Teklad Global 20 % Protein Primate Diet. Tierpflege und experimentelle Verfahren basierten auf genehmigten institutionellen Protokollen der Icahn School of Medicine am Mount Sinai. Alle Mäuse wurden zufällig Versuchsgruppen zugeordnet.

C57BL/6-Mäusen wurden intravenös 89Zr-markierte IL4-Varianten injiziert: IL4 (53,6 ± 6,6 μCi), ApoA1–IL4 (30,1 ± 0,9 μCi), diskoidale IL4-aNPs (146,1 ± 46,5 μCi) und sphärische IL4-aNPs ( 108,6 ± 16,9 μCi). Zwei nichtmenschlichen Primaten wurden scheibenförmige 89Zr-markierte IL4-aNPs (1079 μCi und 682 μCi) injiziert. Zu vorgegebenen Zeitpunkten, 1, 2, 5, 10 und 30 Minuten und 1, 2, 4, 8 und 24 Stunden für Mäuse und 5, 30 und 90 Minuten und 48 Stunden für nichtmenschliche Primaten, wurde nach der Injektion Blut abgenommen und gewogen und die Radioaktivität wurde mit einem automatischen Gammazähler Wizard2 2480 (Perkin Elmer) gemessen. Die Daten wurden hinsichtlich des radioaktiven Zerfalls korrigiert und der Prozentsatz der injizierten Dosis pro Gramm Blut (%ID pro g) berechnet. Die Daten wurden mithilfe einer nichtlinearen zweiphasigen Zerfallsregression in GraphPad Prism angepasst und die gewichtete Bluthalbwertszeit wurde über die Gleichung (% schnell × t1/2 schnell + % langsam × t1/2)/100 berechnet. Die Bioverteilung bei Mäusen wurde 24 Stunden nach der Injektion bestimmt. Nach der PBS-Perfusion wurden die interessierenden Gewebe gesammelt und gewogen, und die Radioaktivität wurde mit einem automatischen Gammazähler Wizard2 2480 (Perkin Elmer) gemessen. Die Daten wurden hinsichtlich des radioaktiven Zerfalls korrigiert und der Prozentsatz der injizierten Dosis pro Gramm Gewebe (%ID pro g) berechnet.

C57BL/6-Mäusen wurden intravenös 89Zr-markierte IL4-Varianten injiziert: IL4 (53,6 ± 6,6 μCi), ApoA1–IL4 (30,1 ± 0,9 μCi), diskoidale IL4-aNPs (146,1 ± 46,5 μCi) und sphärische IL4-aNPs ( 108,6 ± 16,9 μCi). Nach 24 Stunden wurden die Mäuse mit 1,0 % Isofluran in O2 bei einer Flussrate von ca. 1,0 l/min anästhesiert. PET-CT-Scans wurden mit einem Mediso nanoScan PET-CT (Mediso) erfasst. Es wurde ein Ganzkörper-CT-Scan durchgeführt (Energie 50 kVp; Strom 180 μAs; isotrope Voxelgröße 0,25 mm), gefolgt von einem 20-minütigen PET-Scan. Die Rekonstruktion wurde mit Schwächungskorrektur unter Verwendung des TeraTomo 3D-Rekonstruktionsalgorithmus aus der Mediso Nucline-Software v3.04.020.0000 durchgeführt. Die Zufälle wurden durch ein Energiefenster zwischen 400 keV und 600 keV ausgeschlossen. Die Voxelgröße war isotrop mit einer Breite von 0,4 mm und die Rekonstruktion wurde für vier vollständige Iterationen angewendet, sechs Teilmengen pro Iteration.

Die Gewebe wurden in einer Filmkassette gegen eine Phosphorimaging-Platte (BASMS-2325, Fujifilm) bei –20 °C gelegt, um die Radioaktivitätsverteilung zu bestimmen. Die Platten wurden mit einer Pixelauflösung von 25 mm mit einem Plattenlesegerät Typhoon 7000IP (GE Healthcare) gelesen.

Zur zellulären Spezifität wurden Mäusen intravenös DiO-markierte IL4-aNPs injiziert, die man 24 Stunden lang zirkulieren ließ. Anschließend wurden die Mäuse getötet und wie zuvor beschrieben Einzelzellsuspensionen aus Blut, Milz und Knochenmark hergestellt. Zellsuspensionen wurden mit Anti-CD115, Anti-CD11b, Anti-Ly6C, Anti-Ly6G, Anti-CD19, Anti-CD45, Anti-CD11c, Anti-CD3 und Anti-F4/80 inkubiert. Als Lebensfähigkeitsbeize wurde lebendes oder totes Aqua verwendet. Anschließend wurden die Zellen gewaschen und in FACS-Puffer resuspendiert. Alle Daten wurden mit einem Aurora 5 l-Durchflusszytometer (Cytek Biosciences) erfasst. DiO-IL4-aNPs wurden im FITC-Kanal nachgewiesen.

Nach dem Fasten über Nacht wurden nichtmenschliche Primaten mit Ketamin (5 mg kg−1) und Dexmedetomidin (0,0075–0,015 mg kg−1) anästhesiert. Nichtmenschlichen Primaten wurden 1,114 mCi und 0,682 mCi diskoidale 89Zr-markierte IL4-aNPs in einer Dosis von etwa 0,1 mg kg-1 injiziert. Dynamische PET-Bildgebung wurde 60 Minuten nach der Infusion durchgeführt, und zusätzliche statische PET-MRT-Scans wurden 1 Stunde und 48 Stunden nach der Injektion durchgeführt. Darüber hinaus wurde während der Bildgebung 5 Minuten, 30 Minuten und 120 Minuten nach der Injektion Blut entnommen. PET- und MRT-Bilder wurden mit einem 3T-PET-MRT-System (Biograph mMR, Siemens Healthineers) aufgenommen. Gleichzeitig mit der Injektion von aNPs wurde eine dynamische PET-Bildgebung durchgeführt, wobei eine Bettposition verwendet wurde, die Brust und Bauch abdeckte. Die Parameter der MR-Bildgebung waren wie folgt: Aufnahmeebene, koronal; Wiederholungszeit: 1.000 ms; Echozeit: 79 ms; Anzahl der Scheiben: 144; Anzahl der Durchschnittswerte: 4; räumliche Auflösung, 0,5 × 0,5 × 1,0 mm3; und Aufnahmedauer: 42 Minuten und 42 Sekunden. Nach der dynamischen PET-Bildaufnahme wurden statische Ganzkörper-PET-Bilder vom Schädel bis zum Becken in 4 aufeinanderfolgenden Bettpositionen von jeweils 15 Minuten aufgenommen. Gleichzeitig mit jedem Bett wurden MR-Bilder wie oben beschrieben aufgenommen, mit der Ausnahme, dass nur 1,4 Signalmittelwerte, eine Anzahl von Schichten von 160 und eine räumliche Auflösung von 0,6 × 0,6 × 1,0 mm3 verwendet wurden (Aufnahmedauer 14 Minuten und 56 Sekunden pro Bett). Ganzkörper-PET- und MR-Bildgebung wurden auch 48 Stunden nach der Injektion durchgeführt, wobei 4 PET-Bettpositionen von jeweils 30 Minuten mit den folgenden MR-Parametern verwendet wurden: Aufnahmeebene, koronal; Wiederholungszeit: 1.000 ms; Echozeit: 79 ms; Anzahl der Scheiben: 224; Anzahl der Durchschnittswerte: 2; räumliche Auflösung, 0,6 × 0,6 × 1,0 mm3; und Aufnahmedauer: 29 Minuten und 56 Sekunden. Ganzkörper-MR-Bilder von jedem Bett wurden vom Scanner automatisch zusammengestellt. Nach der Erfassung wurden PET-Rohdaten von jedem Bett rekonstruiert und offline unter Verwendung der von Siemens entwickelten e7tools mit einem Algorithmus zur Erwartungsmaximierung geordneter Teilmengen mit Punktverteilungsfunktionskorrektur für 3 Iterationen und 24 Teilmengen zusammengestellt. Außerdem wurde auf die Bilder ein Gaußfilter von 4 mm angewendet. Für die Abschwächung wurde eine Abschwächungskarte für drei Kompartimente (Weichgewebe, Lunge und Luft) verwendet.

Die Bildanalyse wurde mit Osirix MD, Version 11.0, durchgeführt. Ganzkörper-MR-Bilder wurden mit PET-Bildern fusioniert und in einer koronaren Ebene analysiert. Regionen von Interesse (ROIs) wurden auf Geweben von Interesse, einschließlich Milz, Leber, Nieren, Lunge, Herz, Kleinhirn und Großhirn, gezeichnet, die in ihrer Gesamtheit verfolgt wurden, und die Knochenmarksaufnahme wurde anhand von drei Wirbeln in der Lendenwirbelsäule bestimmt. Für jeden ROI wurden mittlere standardisierte Aufnahmewerte (SUVs) berechnet. Die scheibenförmige 89Zr-markierte IL4-aNP-Aufnahme pro Organ wurde als Durchschnitt aller mittleren SUV-Werte pro Organ ausgedrückt.

Für das In-vivo-Toleranzmodell wurden 11 Wochen alte weibliche C57BL/6-Mäuse intraperitoneal mit 0,1 mg kg−1 Körpergewicht LPS toleriert. Nach 24 und 48 Stunden wurden Mäuse intravenös entweder mit 200 µg IL4m-aNPs oder PBS behandelt. Anschließend wurden die Mäuse nach 72 Stunden erneut einer intraperitonealen Injektion von 0,1 mg kg-1 LPS ausgesetzt. Nach 90 Minuten wurden die Mäuse getötet, Blut für den ELISA gesammelt und Einzelzellsuspensionen aus Blut, Milz und Knochenmark wie zuvor beschrieben hergestellt. Für das Färbeprotokoll wurden Blutproben für den ELISA 30 Minuten lang bei RT gerinnen gelassen. Das Serum wurde nach 10-minütiger Zentrifugation bei 1.000 g und 4 °C entnommen. Maus-TNF- und IL6-ELISAs (Biolegend) wurden gemäß den Protokollen des Herstellers durchgeführt. Tierpflege und Versuchsverfahren basierten auf genehmigten institutionellen Protokollen des Nijmegen Animal Experiments Committee.

Sofern nicht anders angegeben, werden die Daten als Mittelwert ± Standardabweichung angezeigt. Einzelne Datenpunkte in Diagrammen sind biologische Replikate, keine technischen Wiederholungen. Die Anzahl der Datenpunkte ist in jeder Abbildung deutlich erkennbar bzw. n ist in der Abbildungslegende angegeben. Sofern nicht anders angegeben, wurden statistische Analysen in Graphpad Prism (v9, Graphpad Software) durchgeführt. Für trainierte Immunitäts- und akute Stimulationsexperimente mit primären menschlichen Monozyten (gepaart, nicht parametrisch) wurden Wilcoxon-Signed-Rank-Tests verwendet. Statistische Methoden zur RNA-Sequenzanalyse sind oben beschrieben. Zweiseitige P-Werte unter 0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die wichtigsten Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, sind im Papier und seinen ergänzenden Informationen verfügbar. Die im Rahmen der Studie generierten Rohdaten und analysierten Datensätze stehen auf begründete Anfrage für Forschungszwecke bei den entsprechenden Autoren zur Verfügung. Rohe RNA-Sequenzierungsdaten sind beim NCBI Gene Expression Omnibus unter der Zugangsnummer GSE185433 erhältlich.

Singer, M. et al. Die dritten internationalen Konsensdefinitionen für Sepsis und septischen Schock (Sepsis-3). JAMA 315, 801–810 (2016).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

van der Poll, T., van de Veerdonk, FL, Scicluna, BP & Netea, MG Die Immunpathologie der Sepsis und potenzielle therapeutische Ziele. Nat. Rev. Immunol. 17, 407–420 (2017).

Artikel PubMed Google Scholar

Bruse, N., Leijte, GP, Pickkers, P. & Kox, M. in Expert Review of Clinical Immunology, Bd. 15, 251–263 (Taylor und Francis, 2019).

van der Poll, T., Shankar-Hari, M. & Wiersinga, WJ Die Immunologie der Sepsis. Immunität 54, 2450–2464 (2021).

Artikel PubMed Google Scholar

Frazier, WJ & Hall, MW Immunparalyse und unerwünschte Folgen einer kritischen Erkrankung. Pädiatr. Klin. North Am. 55, 647–668 (2008).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhao, GJ et al. Inzidenz, Risikofaktoren und Auswirkungen auf die Ergebnisse einer Sekundärinfektion bei Patienten mit septischem Schock: eine retrospektive 8-Jahres-Studie. Wissenschaft. Rep. 6, 38361 (2016).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Netea, MG & Joosten, LAB in Cell Vol. 175, 1463–1465 (Cell Press, 2018).

Netea, MG, Quintin, J. & Van Der Meer, JWM in Cell Host and Microbe Vol. 9, 355–361 (2011).

Cheng, SC et al. Der Immunparalyse bei Sepsis liegen weitreichende Defekte im Energiestoffwechsel von Leukozyten zugrunde. Nat. Immunol. 17, 406–413 (2016).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Netea, MG et al. Definition der trainierten Immunität und ihrer Rolle bei Gesundheit und Krankheit. Nat. Rev. Immunol. 20, 375–388 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Novakovic, B. et al. Beta-Glucan kehrt den epigenetischen Zustand der LPS-induzierten immunologischen Toleranz um. Zelle 167, 1354–1368.e14 (2016).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Mulder, WJM, Ochando, J., Joosten, LAB, Fayad, ZA & Netea, MG Therapeutisches Targeting der trainierten Immunität. Nat. Rev. Drug Discov. 18, 553–566 (2019).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Essner, R., Rhoades, K., McBride, WH, Morton, DL & Economou, JS IL-4 reguliert die IL-1- und TNF-Genexpression in menschlichen Monozyten herunter. J. Immunol. 142, 3857–3861 (1989).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Woodward, EA, Prele, CM, Nicholson, SE, Kolesnik, TB & Hart, PH Die entzündungshemmenden Wirkungen von Interleukin-4 werden nicht durch den Suppressor des Zytokinsignals 1 (SOCS1) vermittelt. Immunologie 131, 118–127 (2010).

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Czimmerer, Z. et al. Der Transkriptionsfaktor STAT6 vermittelt die direkte Unterdrückung von Entzündungsverstärkern und begrenzt die Aktivierung alternativ polarisierter Makrophagen. Immunität 48, 75–90 e76 (2018).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Schrijver, DP et al. in Advanced Therapeutics Vol. 4, 2100083–2100083 (John Wiley & Sons, 2021).

Mulder, WJ et al. Nanopartikuläre Anordnungen von Amphiphilen und diagnostisch aktiven Materialien für die multimodale Bildgebung. Acc. Chem. Res. 42, 904–914 (2009).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Soto-Heredero, G., Gomez de Las Heras, MM, Gabande-Rodriguez, E., Oller, J. & Mittelbrunn, M. Glykolyse – ein wichtiger Akteur bei der Entzündungsreaktion. FEBS J. 287, 3350–3369 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

McCormick, SM & Heller, NM Kommentar: IL-4- und IL-13-Rezeptoren und Signalübertragung. Cytokine 75, 38–50 (2015).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Letellier, E. & Haan, S. SOCS2: physiologische und pathologische Funktionen. Vorderseite. Biowissenschaften. 8, 189–204 (2016).

Artikel Google Scholar

Yan, Y. et al. CCL19- und CCR7-Expression, Signalwege und Adjuvansfunktionen bei Virusinfektionen und -prävention. Vorderseite. Zellentwickler. Biol. https://doi.org/10.3389/fcell.2019.00212 (2019).

Keating, ST et al. Die Set7-Lysin-Methyltransferase reguliert die Plastizität bei der oxidativen Phosphorylierung, die für die durch β-Glucan induzierte trainierte Immunität notwendig ist. Cell Rep. 31, 107548 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

van Leent, MMT et al. Regulierung der trainierten Immunität mit Nanomedizin. Nat. Rev. Mater. 7, 465–481 (2022).

Artikel Google Scholar

Varin, A., Mukhopadhyay, S., Herbein, G. & Gordon, S. Die alternative Aktivierung von Makrophagen durch IL-4 beeinträchtigt die Phagozytose von Krankheitserregern, verstärkt jedoch die mikrobiell induzierte Signalübertragung und Zytokinsekretion. Blut 115, 353–362 (2010).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

D'Andrea, A., Ma, Mononukleäre Zellen des peripheren Blutes: Vorbereitung auf die Produktion von IL-12 und Tumornekrosefaktor Alpha. J. Exp. Med. Rev. 181, 537–546 (1995).

Artikel PubMed Google Scholar

Divangahi, M. et al. in Nature Immunology Vol. 22, 2–6 (Nature Publishing Group, 2021).

de Graaf, DM et al. IL-38 verhindert die Induktion einer trainierten Immunität durch Hemmung der mTOR-Signalübertragung. J. Leukoc. Biol. 110, 907–915 (2021).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Cavalli, G. et al. Das entzündungshemmende Zytokin Interleukin-37 ist ein Inhibitor der trainierten Immunität. Cell Rep. 35, 108955 (2021).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Cheng, SC et al. mTOR- und HIF-1alpha-vermittelte aerobe Glykolyse als metabolische Grundlage für trainierte Immunität. Wissenschaft 345, 1250684 (2014).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Sander, J. et al. Die zelluläre Differenzierung menschlicher Monozyten wird durch zeitabhängige Interleukin-4-Signale und den Transkriptionsregulator NCOR2 reguliert. Immunity 47, 1051–1066.e12 (2017).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Giamarellos-Bourboulis, EJ et al. Komplexe Immundysregulation bei COVID-19-Patienten mit schwerem Atemversagen. Cell Host Microbe 27, 992–1000.e3 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zaman, R. et al. Aktuelle Strategien zur Verlängerung der Halbwertszeit therapeutischer Proteine. J. Kontrolle. Veröffentlichung 301, 176–189 (2019).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Priem, B. et al. Eine trainierte immunitätsfördernde nanobiologische Therapie unterdrückt das Tumorwachstum und verstärkt die Checkpoint-Hemmung. Zelle 183, 786–801.e719 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Nakamura, K. & Smyth, MJ Myeloische Immunsuppression und Immun-Checkpoints in der Tumormikroumgebung. Zellmol. Immunol. 17, 1–12 (2020).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Perros, AJ et al. Eine Koronararterien-Bypass-Transplantation ist mit einer Immunparalyse von Monozyten und dendritischen Zellen verbunden. J. Zelle. Mol. Med. 24, 4791–4803 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hernandez-Jimenez, E. et al. Zirkulierende Monozyten weisen nach einem akuten ischämischen Schlaganfall einen Endotoxintoleranzstatus auf: mitochondriale DNA als mögliche Erklärung für Infektionen nach einem Schlaganfall. J. Immunol. 198, 2038–2046 (2017).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Tschoeke, SK & Ertel, W. Immunparalyse nach multiplem Trauma. Verletzung 38, 1346–1357 (2007).

Artikel PubMed Google Scholar

Bekkering, S. et al. In-vitro-Versuchsmodell der trainierten angeborenen Immunität in menschlichen primären Monozyten. Klin. Impfstoff. Immunol. 23, 926–933 (2016).

Artikel CAS Google Scholar

Dominguez-Andres, J. et al. In-vitro-Induktion einer trainierten Immunität in adhärenten menschlichen Monozyten. STAR-Protokoll. 2, 100365 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

van Lier, D., Geven, C., Leijte, GP & Pickkers, P. Experimentelle menschliche Endotoxämie als Modell einer systemischen Entzündung. Biochemie 159, 99–106 (2019).

Artikel PubMed Google Scholar

Langmead, B. Ausrichten kurzer Sequenzierungslesungen mit Bowtie. Curr. Protokoll. Bioinformatik https://doi.org/10.1002/0471250953.bi1107s32 (2010).

Turro, E. et al. Schätzung der Haplotyp- und Isoform-spezifischen Expression mithilfe von Multi-Mapping-RNA-Sequenz-Lesevorgängen. Genombiol. 12, R13 (2011).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Love, MI, Huber, W. & Anders, S. Moderierte Schätzung der Faltungsänderung und Streuung für RNA-seq-Daten mit DESeq2. Genombiol. 15, 550 (2014).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Heinz, S. et al. Einfache Kombinationen abstammungsbestimmender Transkriptionsfaktoren bilden die Grundlage für cis-regulatorische Elemente, die für die Identität von Makrophagen und B-Zellen erforderlich sind. Mol. Zelle 38, 576–589 (2010).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bekkering, S. et al. Die Behandlung mit Statinen führt bei Patienten mit familiärer Hypercholesterinämie nicht zu einer Wiederherstellung der trainierten Immunität. Zellmetabolismus 30, 1–2 (2019).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Hirschfeld, M., Ma, Y., Weis, JH, Vogel, SN & Weis, JJ Spitzenreiter: Durch die erneute Reinigung von Lipopolysacchariden wird die Signalübertragung durch den Toll-like-Rezeptor sowohl beim Menschen als auch bei der Maus eliminiert 2. J. Immunol. 165, 618–622 (2000).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Ovesný, M., Křížek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z. & Hagen, GM ThunderSTORM: ein umfassendes ImageJ-Plug-in für PALM- und STORM-Datenanalyse und hochauflösende Bildgebung. Bioinformatik 30, 2389–2390 (2014).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

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Wir danken M. Jaeger (Radboudumc) für die freundliche Bereitstellung von Fluoresceinisothiocyanat-markiertem Candida albicans. D. Williams (East Tennessee State University) stellte das β-Glucan zur Verfügung, das wir in unseren ersten Experimenten verwendeten. H. Lemmers (Radboudumc) stellte freundlicherweise das gereinigte Lipopolysaccharid her, das zur Stimulation primärer menschlicher Monozyten und Makrophagen verwendet wird. Ein Teil der Zahlen wurde (unter anderem mit Software) Biorender.com erstellt. BN wird durch einen Investigator Grant des National Health and Medical Research Council (Australia) (APP1173314) unterstützt. Diese Arbeit wurde durch die Zuschüsse R01 HL144072, R01 CA220234 und P01 HL131478 der National Institutes of Health sowie durch einen Vici-Zuschuss des niederländischen Forschungsrates NWO und einen ERC Advanced Grant (alle an WJMM) unterstützt. MGN wurde durch ein Spinoza-Stipendium des niederländischen Forschungsrats NWO und ein ERC Advanced Grant (#833247) unterstützt.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: David P. Schrijver, Rutger J. Röring.

Abteilung für Biomedizintechnik, Technische Universität Eindhoven, Eindhoven, Niederlande

David P. Schrijver, Jeroen Deckers, Anne de Dreu, Eveline G. Nugraha, Roderick S. Oosterwijk, Ewelina Kluza, Roy van der Meel, Maarten Merkx und Willem JM Mulder

Abteilung für Innere Medizin und Radboud-Zentrum für Infektionskrankheiten (RCI), Radboud University Medical Center, Nijmegen, Niederlande

David P. Schrijver, Rutger J. Röring, Jeroen Deckers, Yohana C. Toner, Bram Priem, Yuri van Elsas, Tom Anbergen, Simone JCFM Moorlag, Thijs J. Beldman, Leo AB Joosten, Mihai G. Netea und Willem JM Mulder

Radboud Institute for Molecular Life Sciences, Radboud University Medical Center, Nijmegen, Niederlande

Rutger J. Röring, Jeroen Deckers, Tom Anbergen, Anouk MD Becker, Simone JCFM Moorlag, Aron Jansen, Peter Pickkers, Matthijs Kox, Leo AB Joosten und Mihai G. Netea

Institut für Biomedizintechnik und Bildgebung, Icahn School of Medicine am Mount Sinai, New York, NY, USA

Yohana C. Toner, Geoffrey Prevot, Bram Priem, Jazz Munitz, Yuri van Elsas, Anthony Azzun, Carlos Pérez-Medina, Mandy MT van Leent, Abraham JP Teunissen und Zahi A. Fayad

Abteilung für Medizinische Biochemie, Medizinische Zentren der Universität Amsterdam, Amsterdam, Niederlande

Bram Prime

Angiogenese-Labor, Amsterdam UMC, Krebszentrum Amsterdam, Amsterdam, Niederlande

Bram Prime

Abteilung für Chirurgie, Radboud University Medical Center, Nijmegen, Niederlande

Laszlo A. Groh

Radboud-Institut für Gesundheitswissenschaften, Radboud University Medical Center, Nijmegen, Niederlande

Laszlo A. Groh

Abteilung für Tumorimmunologie, RIMLS, Radboud University Medical Center, Nijmegen, Niederlande

Anouk MD Becker

Nationales Zentrum für Herz-Kreislauf-Forschung (CNIC), Madrid, Spanien

Carlos Perez-Medina

Epigenetics Group, Murdoch Children's Research Institute, Royal Children's Hospital und Abteilung für Pädiatrie, University of Melbourne, Parkville, Victoria, Australien

Boris Novakovic

Abteilung für Intensivmedizin und Radboud-Zentrum für Infektionskrankheiten (RCI), Radboud University Medical Center, Nijmegen, Niederlande

Aron Jansen, Peter Pickkers & Matthijs Kox

Kardiovaskuläres Forschungsinstitut, Icahn School of Medicine am Mount Sinai, New York, NY, USA

Mandy MT van Leent & Abraham JP Teunissen

Abteilung für Medizinische Genetik, Iuliu Hatieganu Universität für Medizin und Pharmazie, Cluj-Napoca, Rumänien

Leo AB Joosten

Abteilung für Kardiologie, Abteilung für Medizin, Marc und Ruti Bell-Programm für Gefäßbiologie, New York University School of Medicine, New York, NY, USA

Edward A. Fisher

Abteilung für Genomik und Immunregulation, Life and Medical Sciences Institute (LIMES), Universität Bonn, Bonn, Deutschland

Mihai G. Netea

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WJMM und MGN konzipierten die Studie. WJMM, MGN, ZAF, EAF und RvdM überwachten die Studie. RJR, SJCFMM und LABJ entschlüsselten die Wirkungsweise von IL4. DPS, JD, AdD und MM haben Fusionsproteine ​​entworfen, exprimiert und optimiert. DPS, JD, AdD, RSO, EGN, GP, AA, CP-M., EK und AJPT produzierten, markierten und charakterisierten Nanopartikel. DPS, RJR, LAG, AMDB, BN, MK, AJ, PP und TJB führten Ex-vivo- (Mensch), In-vivo- und In-vitro-Experimente durch. DPS, RJR, YCT, JD, BP, JM, YvE, TA und MMTvL führten In-vivo- und Ex-vivo-Experimente mit nichtmenschlichen Mausprimaten durch. DPS, RJR, MGN und WJMM haben das Manuskript geschrieben und die Zahlen erstellt. Alle Autoren überprüften das Manuskript und gaben Feedback.

Korrespondenz mit Mihai G. Netea oder Willem JM Mulder.

WJMM, LABJ und MGN sind wissenschaftliche Mitbegründer von Trained Therapeutix Discovery und haben Anteile daran. WJMM ist CSO von Trained Therapeutix Discovery. WJMM und MGN sind wissenschaftliche Mitbegründer von BioTrip und besitzen Anteile daran.

Nature Biomedical Engineering dankt Jeffrey Hubbell, Srinivasa Reddy und Markus Weigand für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

(a) Laktatspiegel im Überstand nach 24-stündiger Stimulation mit IL4. (b) Kumulierte Laktatspiegel im Überstand am Tag 6 nach dem IL4-Training. (c) Durchflusszytometrische Messung der FITC-markierten Candida albicans-Phagozytose am Tag 6 nach dem IL4-Training. (d) Durchflusszytometrische Messung von Oberflächenmarkern, die üblicherweise mit der IL4-Aktivierung von Monozyten/Makrophagen assoziiert sind, am Tag 6 nach dem IL4-Training. (e) Durchflusszytometrische Messung des dendritischen Zellmarkers CD1c an IL4-trainierten Makrophagen und von Monozyten abgeleiteten dendritischen Zellen (moDC). Die Daten werden als Mittelwert (Durchflusszytometrie: geometrische mittlere Fluoreszenzintensität) ± SD dargestellt.

(a) TNF/IL6-Produktion nach erneuter Stimulation von Zellen, die mit IL4 trainiert wurden, während sie wichtige IL4-Signalwege blockierten. (b) Mehrfacher Anstieg von TNF/IL6 nach erneuter Stimulation von Zellen, die mit IL4 trainiert wurden, während sie wichtige IL4-Signalwege blockierten . (c) Heatmap des Transkriptoms von Monozyten direkt nach der Isolierung und nach Stimulation mit RPMI, IL4, LPS oder LPS+IL4. (d) Transkriptionsfaktor-Motivanreicherungsanalyse der akuten IL4-Effekte auf LPS-stimulierte Monozyten. (e) Signalweganreicherungsanalysen der Wirkung von IL4 auf die akute LPS-Stimulation. (f) ChIP-qPCR-Analyse von TNF in IL4-trainierten Zellen. Die Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt.

Kinetik der IL4-Bindung an IL4Rα mittels SPR.

(a) DLS-Bewertung der Partikelgröße herkömmlicher aNPs. (b) DLS-Stabilität herkömmlicher aNPs im Zeitverlauf.

(a) Organautoradiographie 24 Stunden nach der Injektion von 89Zr-IL4-aNPs in Mäuse. (b) Gammazahl in lebenswichtigen Organen 24 Stunden nach der Injektion von 89Zr-IL4-aNPs bei Mäusen (n = 5). (c) Aufnahmeverhältnisse durch Zielorgane gegenüber Clearance-Organen in Mäusen 2-Wege-ANOVA mit Türkei-Post-hoc-Analyse. (d) Dynamische PET/MRT-Scans von nichtmenschlichen Primaten 1, 30 und 60 Minuten nach der Injektion von 89Zr-IL4-aNPs. (e) Organspezifischer SUV-Mittelwert bei nichtmenschlichen Primaten über 1 Stunde nach der Verabreichung von 89Zr-IL4-aNPs. (f) Gating-Strategie für Knochenmark (oben) und Milz (unten) in Experimenten zur Messung der Zelltypspezifität von DiO-markierten diskoidalen IL4-aNPs. Die Daten werden gegebenenfalls als Mittelwert ± SD dargestellt.

(a) Phosphorylierung von STAT6, gemessen durch Durchflusszytometrie nach 30-minütiger Stimulation mit RPMI, IL4 oder verschiedenen Konzentrationen von IL4-aNPs. Die Daten werden relativ zu dem durch bloßes IL4 hervorgerufenen Signal ausgedrückt. (d) T-Zell-Polarisationsassay mittels Durchflusszytometrie nach 7 Tagen gemischter Leukozytenreaktion mit IL4(-aNP)-trainierten Makrophagen oder Kontrolle. (b) TNF-Produktion nach LPS-Stimulation von Monozyten, die vor und 4 Stunden nach der In-vivo-Endotoxinbelastung beim Menschen isoliert wurden. (c) TNF- und IL6-Spiegel nach Ex-vivo-Restimulation menschlicher in vivo LPS-tolerierter Zellen (links) und dieselben Daten, ausgedrückt als fache Änderungen im Vergleich zu den toleranten Endotoxämie-Proben (rechts).

Ergänzende Tabellen 1–5 und unverarbeitete SDS-PAGE-Gele und Western Blots für Abb. 3.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Schrijver, DP, Röring, RJ, Deckers, J. et al. Behebung einer Sepsis-induzierten Immunparalyse durch trainierte Immunität durch gezielte Ausrichtung von Interleukin-4 auf myeloische Zellen. Nat. Biomed. Eng (2023). https://doi.org/10.1038/s41551-023-01050-0

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Eingegangen: 21. Dezember 2021

Angenommen: 02. Mai 2023

Veröffentlicht: 08. Juni 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41551-023-01050-0

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