Das Weizenstammrost-Resistenzgen Sr43 kodiert für eine ungewöhnliche Proteinkinase

Nature Genetics (2023)Diesen Artikel zitieren

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Um Brotweizen vor Schädlingen und Krankheiten zu schützen, haben Züchter über 200 Resistenzgene in sein Genom eingeführt und damit die Anzahl der ausgewiesenen Resistenzgene im Weizen-Genpool nahezu verdoppelt1. Die Isolierung dieser Gene erleichtert ihre schnelle Einbindung in Zuchtprogramme und den Einbau in Polygenstapel für eine dauerhaftere Resistenz. Wir haben das Stammrostresistenzgen Sr43 geklont, das aus dem Wildgras Thinopyrum elongatum2,3 in Brotweizen eingekreuzt wurde. Sr43 kodiert für eine aktive Proteinkinase, die mit zwei Domänen unbekannter Funktion fusioniert ist. Das nur bei den Triticeae vorkommende Gen scheint durch eine Genfusion vor 6,7 bis 11,6 Millionen Jahren entstanden zu sein. Die transgene Expression von Sr43 in Weizen verlieh einem breiten Spektrum von Isolaten des Erregers, der Stammrost verursacht, ein hohes Maß an Resistenz, was den potenziellen Wert von Sr43 in der Resistenzzüchtung und -technik unterstreicht.

Weltweit gehen jedes Jahr etwa 20 % der prognostizierten Produktion von Brotweizen (Triticum aestivum) durch Schädlinge und Krankheiten verloren4. Der Einsatz genetischer Variation zur Krankheitsresistenz ist eine nachhaltige und umweltfreundliche Möglichkeit, Weizenpflanzen zu schützen5. Seit über 100 Jahren führen Züchter zahlreiche Kreuzungen durch, um den Genpool von Weizen mit Resistenzgenen anzureichern. Bemerkenswert ist, dass mehr als 200 der derzeit 467 ausgewiesenen Resistenzgene in kultiviertem Brotweizen ihren Ursprung außerhalb des Brotweizen-Genpools haben1. Der Einsatz dieser interspezifischen Resistenzgene wird jedoch häufig durch Linkage Drag behindert, d. h. durch die gleichzeitige Einführung schädlicher Allele aus verknüpften Genen. Darüber hinaus werden einzelne Resistenzgene tendenziell schnell durch die Entstehung von Resistenz-brechenden Krankheitserregerstämmen überwunden6. Das Klonen einzelner Resistenzgene würde ihre Einführung als genetisch veränderte Polygenstapel ermöglichen, die wahrscheinlich eine dauerhaftere Resistenz bieten7.

Die meisten der etwa 291 bisher klonierten Resistenzgene gegen Pflanzenkrankheiten kodieren entweder für intrazelluläre Rezeptoren der Klasse der Nukleotid-bindenden und Leucin-reichen Wiederholungen (NLR) oder für extrazelluläre membranverankerte Rezeptor-ähnliche Proteine (RLPs, RLKs genannt, wenn sie eine intrazelluläre Kinase enthalten). ) (Ergänzungstabelle 1)1,8. Kürzlich wurde eine neue Gruppe von Resistenzgenen entdeckt, deren Mitglieder zwei Proteinkinasen kodieren, die zu einem Protein verschmolzen sind. Zu diesen Tandem-Kinase-Genen gehören Rpg1, Yr15, Sr60, Sr62, Pm24, WTK4 und Rwt4 (Ref. 9,10,11,12,13,14,15). Andere Resistenzgene bieten eine gewisse Variation dieser Architektur mit Proteinkinasen, die mit einer steroidogenen akuten regulatorischen Protein-bezogenen Lipidtransferdomäne (Yr36)16, einer C2-Domäne und einer Multitransmembranregion (Pm4)17, einem wichtigen Spermienprotein (Snn3)18, fusioniert sind. ein NLR (Tsn1, Rpg5 und Sm1)19,20,21 und eine Von-Willebrand-Faktor-Typ-A-Domäne (Lr9)22.

Diese Kinase-Fusionsprotein-kodierenden Resistenzgene scheinen einzigartig bei den Triticeae zu sein, der Gräsergruppe, die vor 12 Millionen Jahren entstand und die Getreidearten Weizen, Roggen (Secale Cereale) und Gerste (Hordeum vulgare) umfasst23. Die Fusionsereignisse, die diese Gene hervorbrachten, waren jedoch keineswegs selten und isoliert, sondern ereigneten sich häufig zwischen verschiedenen Klassen von Kinasen und führten zu vielfältigen Kombinationen10,12. Diese genomische Innovation führte zu einer Resistenz gegen phylogenetisch unterschiedliche Pilzpathogene, die sich über die etwa 300 Millionen Jahre alte Ascomyceten/Basidiomyceten-Kluft erstreckten.

Hier haben wir das Stammrost-Resistenzgen Sr43 geklont, das vor 45 Jahren von hohem Weizengras (Thinopyrum elongatum) in Brotweizen übertragen wurde2,3. Das dominante Resistenzgen Sr43 wurde in Chromosom 7D von hexaploidem Weizen eingeführt (Abb. 1a, b). Wir haben Körner der Sr43-Introgressionslinie mit Ethylmethansulfonat (EMS) mutagenisiert und 2.244 überlebende M2-Familien auf Anfälligkeit für Puccinia graminis f. untersucht. sp. tritici (Pgt). Wir haben 23 Familien identifiziert, die sich aufgrund der Anfälligkeit für Stammrost aufspalten, und von denen wir zehn unabhängige Mutanten durch Nachkommentests (Ergänzungstabelle 2) und Genotypisierung (Ergänzungsabbildungen 1 bis 11) bestätigt haben.

a, Th. Elongatum-Chromosom 7. b, Schematische Darstellung des Weizen-Thinopyrum-Translokationschromosoms. c, Identifizierte EMS-Mutationen entlang des vorhergesagten Sr43-Genmodells. d, Schematisches Diagramm von Sr43, das die vorhergesagten Domänen und Aminosäureänderungen zeigt, die durch die EMS-Mutationen hervorgerufen werden. e, Dreidimensionales Modell von Sr43, wie von AlphaFold vorhergesagt. Grün, Kinase; Orange und Blau, DUF-Domänen; gelbe, flexible Linker. f, Strukturdetail (gestrichelter Kasten in e) einer hochzuverlässigen ATP-Bindungsstelle (rote Reste) in DUF668, gebunden an ein ATP-Molekül, bestimmt durch das Andockprogramm für kleine Moleküle HADDOCK28. ATP wird als Stabstruktur (hellgrün) dargestellt, die über Wasserstoffbrückenbindungen (rote Linien) mit DUF668-Resten verbunden ist.

Um Sr43 zu klonen, führten wir eine Chromosomenflusssortierung durch und sequenzierten den Weizen-Th. rekombinantes Elongatum-Chromosom 7D in der Elternlinie und acht Mutanten (Extended Data Abb. 1 und Ergänzungstabellen 3 und 4). Die Sequenzassemblierung der Elternlinie und die Kartierung der Mutanten-Reads identifizierten ein 10 Kilobasen (kb) großes Fenster in einem Gerüst, das eine Mutation in allen acht Mutanten enthielt. Um die Genstruktur des Sr43-Kandidaten zu bestimmen, führten wir (1) eine Transkriptom-Deep-Sequencing-Analyse (RNA-seq) von Sr43-Sämlingsblättern durch und ordneten die Lesevorgänge dem Sr43-Genomgerüst zu (Extended Data Abb. 2a) und (2) sequenzierten Sr43 Klone, die durch Polymerasekettenreaktion (PCR) aus einer komplementären DNA-Bibliothek voller Länge erhalten wurden. Wir haben vier verschiedene Spleißvarianten entdeckt (Extended Data Abb. 2b und Ergänzungstabellen 5 und 6). Spleißvariante 1 enthielt alle acht Mutationen und bestand aus 18 Exons mit einem vorhergesagten offenen Leserahmen von 2.598 Basenpaaren (bp) (Abb. 1c). Die acht Mutationen waren alle für die EMS-Mutagenese typische G/C-zu-A/T-Übergänge und führten nicht-synonyme Veränderungen (sieben Mutanten) oder ein frühes Stoppcodon in der vorhergesagten Kodierungssequenz ein (Abb. 1c, d und Ergänzungstabellen 7 und 8). . Die Wahrscheinlichkeit, dass alle Mutanten allein durch Zufall eine Mutation in demselben Gen von den 5.822 nicht-redundanten Genen von Chromosom 7D (Lit. 24) aufweisen würden, betrug 4 × 10–6, was darauf hinweist, dass das identifizierte Gen ein guter Kandidat für Sr43 ist .

Da alle identifizierten EMS-Mutationen das vorherrschende Sr43-Transkript voller Länge beeinflussten (Abb. 1c), verwendeten wir seine vorhergesagte 866-Aminosäuresequenz, um nach funktionellen Domänen und Homologen zu suchen. Wir haben festgestellt, dass Sr43 an seinem C-Terminus eine N-terminale Kinasedomäne und zwei Domänen unbekannter Funktion (DUFs) enthält (Abb. 1d). Fünf der Mutationen befanden sich innerhalb der Kinasedomäne, wobei die verbleibenden drei Mutationen beide DUFs betrafen (Abb. 1d).

Das nächstgelegene BLAST-Homolog der Sr43-Kinasedomäne war die Serin/Threonin-Kinase-Interleukin-1-Rezeptor-assoziierte Kinase (STKc IRAK) (ergänzende Abbildung 12), was darauf hinweist, dass Sr43 wahrscheinlich eine Kinase ist. Weitere Homologiesuchen legten nahe, dass die Kinasedomäne intakt ist (ergänzende Abbildung 13). Zur Untermauerung dieser Beobachtung stellten wir fest, dass ein aus Eschericia coli gereinigtes, mit Affinität markiertes Sr43-Fusionsprotein die DNA-Gyrase des maltosebindenden Proteins in vitro phosphorylierte (Ergänzende Abbildungen 14–16 und Ergänzungstabelle 9). Darüber hinaus zerstörte die Mutante 1013a einen der konservierten Glycinreste in der glycinreichen Schleife, was darauf hindeutet, dass Kinaseaktivität für die Sr43-Funktion erforderlich ist (Ergänzungstabelle 10). Der C-Terminus von Sr43, der DUF3475 und DUF668 enthält, weist eine ähnliche Domänenarchitektur (44 % Identität) auf wie der N-Terminus der PHYTOSULFOKINE SIMULATOR (PSI)-Proteine aus Arabidopsis (Arabidopsis thaliana), die für das Pflanzenwachstum von entscheidender Bedeutung sind25. Im Gegensatz zu Arabidopsis PSI1 fehlte Sr43 ein mutmaßliches Kernlokalisierungssignal oder eine mutmaßliche Myristoylierungsstelle. Sr43 hatte keine Transmembrandomäne, wie von InterPro vorhergesagt. Wir haben jedoch festgestellt, dass sich Sr43 wahrscheinlich im Zellkern, im Zytoplasma und in den Plastiden befindet, was durch die Fluoreszenz belegt wird, die bei der vorübergehenden Expression eines Sr43-GFP-Konstrukts (grün fluoreszierendes Protein) in Blattepidermiszellen von Nicotiana benthamiana nachgewiesen wurde (Erweiterte Daten, Abb. 3). . Die nukleare und zytoplasmatische Lokalisierung wurde in mit Sr43-GFP transfizierten Weizenprotoplasten bestätigt (Extended Data Abb. 3).

Die Domänenstruktur von Sr43 unterschied sich somit deutlich von der der Proteine, die von den ca. 290 geklonten Pflanzenresistenzgenen kodiert werden, bei denen es sich größtenteils (73 %) um extrazelluläre oder intrazelluläre Immunrezeptoren handelte (Ergänzungstabelle 1). Um die ungewöhnliche Struktur von Sr43 detaillierter zu untersuchen, haben wir das mit künstlicher Intelligenz erweiterte AlphaFold-System verwendet, um ein dreidimensionales (3D) Modell zu erstellen26 (Ergänzungsdaten 1). Wir haben festgestellt, dass Sr43 eine modulare Struktur annimmt, wobei die Kinase und die beiden DUFs durch flexible Linkerschleifen getrennt sind (Abb. 1e). Die Kinasedomäne enthielt α-Helices und antiparallele β-Stränge, wohingegen die DUFs vollständig ⍺-helikal waren. Wir verglichen die vorhergesagte Struktur des Sr43-Proteins mit denen in der Proteindatenbank27. Dabei wurden strukturelle Ähnlichkeiten zwischen DUF668 und einigen rezeptorähnlichen Proteinkinase-ähnlichen Proteinen außerhalb ihrer Kinasedomänen identifiziert. Wir suchten mit dem Andockprogramm für kleine Moleküle HADDOCK28 nach ATP-Bindungsstellen und identifizierten eine ATP-Bindungsstelle mit hoher Zuverlässigkeit in DUF668 (Abb. 1f, Ergänzungstabelle 11 und Ergänzungsdaten 2).

Wir klonierten ein 14 kb großes genomisches Sr43-Fragment, einschließlich 3,2 kb stromaufwärts gelegener und 2,5 kb stromabwärts gelegener regulatorischer Sequenz (Abb. 2a) (Ergänzungstabelle 12) und führten das resultierende binäre Konstrukt in die Weizensorte Fielder ein. Wir erhielten eine primäre (T0) transgene Pflanze und identifizierten auf der Grundlage quantitativer PCR (qPCR) eine genetisch stabile Linie mit geschätzten zwei Kopien von Sr43 (Ergänzungstabellen 13–14 und ergänzende Abbildung 17). Wir haben homozygote T1- und T2-Linien gegen eine geografisch und phänotypisch vielfältige Gruppe von 11 Pgt-Isolaten aus Nordamerika, dem Nahen Osten, Europa und Afrika getestet. In zehn Fällen waren die transgenen Sr43- und Wildtyp-Introgressionslinien resistent, wohingegen die Sorten Chinese Spring (der Introgressionselternteil) und Fielder anfällig waren (Abb. 2b, erweiterte Daten Abb. 4a, b und Ergänzungstabelle 15). Im Gegensatz dazu war das Pgt-Isolat 75ND717C auf den Sr43-Introgressions- und transgenen Linien mittelmäßig virulent (Abb. 2b). Für das Pgt-Isolat 69MN399 verglichen wir den Phänotyp bei 21 °C und 26 °C und stellten im Einklang mit früheren Beobachtungen eine deutliche Verringerung der Sr43-vermittelten Resistenz bei der höheren Temperatur fest (Abb. 2c). Zusammengenommen bestätigen diese Ergebnisse (1) die Breitbandwirksamkeit von Sr43 (Lit. 29), (2) dass ein 14 kb großes Sr43-Genomfragment für die Funktion ausreicht und (3) dass die transgene Linie das Rassenspezifische getreu wiedergibt und temperaturempfindliche Resistenz von Wildtyp Sr43.

a, Schematische Darstellung des Sr43-Genomfragments, das für die Transformation in Weizen-CV verwendet wird. Feldspieler. b, Repräsentative Blätter von Sämlingen von Sr43-Wildtyp- und transgenen Linien neben nicht-transgenen Wildtyp-Fielder- und Nullkontrollen, die mit P. graminis f inokuliert wurden. sp. tritici isoliert 14GEO189-1 (avirulent auf Sr43) und 75ND717C (mittelmäßig virulent auf Sr43). c, Einfluss der Temperatur auf die Sr43-vermittelte Resistenz gegen das Pgt-Isolat 69MN399. Maßstabsleiste, 1 cm.

Wir haben nach Sr43-Homologen gesucht, um seinen evolutionären Ursprung zu untersuchen. Wir identifizierten Proteine, die entweder die Kinasedomäne oder nur die beiden DUFs in der Familie der Poaceae enthalten und sich über 60 Millionen Jahre Evolution erstrecken (Ergänzungstabellen 16 und 17 und erweiterte Daten, Abbildungen 5 und 6). Wir haben die Anordnung der Sr43-Proteindomänen nur innerhalb der Gattungen Thinopyrum, Triticum, Aegilops und Secale des Triticeae-Stammes entdeckt, nicht jedoch innerhalb von Hordeum, was darauf hindeutet, dass Sr43 wahrscheinlich vor 6,7 bis 11,6 Millionen Jahren entstand (Abb. 3 und Ergänzungstabelle 18). In den Abstammungslinien, denen ein klares Sr43-Homolog fehlt, haben wir Gene, die für die in Sr43 vorhandene Kinase und DUFs kodieren, auf verschiedene Chromosomen (z. B. Sorghum bicolor, Zea mays, T. urartu und Ae. sharonensis) oder auf dasselbe Chromosom, jedoch 6–36, abgebildet Megabasen (Mb) voneinander entfernt (Ae. tauschii und Setaria italica), was darauf hindeutet, dass die Rekrutierung der Kinasedomäne für die DUFs am Sr43-Locus ein ektopisches Rekombinationsereignis beinhaltete (Ergänzungstabelle 18). In Thinopyrum elongatum wurden der angestammte Zustand und Sr43 als Intraspezies-Polymorphismus beibehalten; Einige Arten von Aegilops und Triticum behielten den angestammten Zustand bei (z. B. Ae. tauschii), während andere die Sr43-Innovation beibehielten (z. B. die Genome von T. aestivum und T. durum B) (Abb. 3).

An jedem Knoten wird anhand von Referenz das Alter des letzten gemeinsamen Vorfahren in Millionen Jahren angegeben. 23. Die Triticeae-Gruppe ist grau hervorgehoben. Die Arten sind unten angegeben und wie folgt abgekürzt: Tel, Thinopyrum elongatum; Asp, Ae. speltoides; TtB, Triticum turgidum ssp. Durum-B-Genom; TdB, T. dicoccoides B-Genom; TaB, T. aestivum B-Genom; TtA, T. turgidum ssp. Durum-A-Genom; TdA, T. dicoccoides A-Genom; TaA, T. aestivum A-Genom; Tu, T. Schnee; Oder Aegilops bicornis; Ase, Ae. Searsie; Oder: Ae. longissima; Esche, Aegilops sharonensis; At, Ae. tauschii; TaD, T. aestivum D-Genom; Sc, Getreideschuppen; Hv, Hordeum vulgare; Als Sativa-Hafer; Bd, Brachypodium-Ablösung; Os, Oryza sativa; Ja, Setaria italica; Sb, Sorghum zweifarbig; Zm, Zea-Mais. Die Anzahl der analysierten Genome für jede Art ist in Klammern angegeben.

Zusammenfassend haben wir das Weizenstamm-Rostresistenzgen Sr43 geklont, das eine Proteinkinase kodiert, die mit zwei DUFs fusioniert ist. Von den bisher klonierten 82 Triticeae-Resistenzgenen kodieren die meisten für NLRs (n = 46), gefolgt von Proteinkinase-Fusionsproteinen (n = 15) (Ergänzungstabelle 19). Von den letzteren sind sieben Tandemkinasen, wohingegen Sr43, Pm4, Snn3, Sm1, Tsn1, Yr36, Rpg5 und Lr9 Einzel- oder Tandemproteinkinasen sind, die an verschiedene Domänen fusioniert sind16,17,18,19,20,21,22 (Erweiterte Daten). Abb. 7 und Ergänzungstabelle 20). Über die Funktion von Kinase-Fusionsproteinen ist wenig bekannt, aber die meisten verleihen eine rassenspezifische Resistenz, die phänotypisch nicht von einer NLR-vermittelten Resistenz zu unterscheiden ist. Ihre kodierenden Gene fallen nicht in die Lr34/Lr67-Kategorie der Erwachsenen-, Breitband- und Multipathogenresistenz30,31. Um die Rolle dieser Kinasen bei der Resistenz zu erklären, suchten wir nach Hinweisen von NLRs, deren Arbeitsweise mittlerweile gut verstanden ist. NLRs können als Wächter fungieren, die Wirtskomponenten überwachen, auf die Krankheitserreger-Effektoren abzielen32. Diese Wächter erkennen die Interaktion zwischen einem Effektor und seinem Ziel, was zu einer Konformationsänderung im NLR führt, die nachgeschaltete Abwehrreaktionen auslöst. Diese dreigliedrige Interaktion führt zu einem evolutionären „Tauziehen“, das selektiven Druck (1) auf den Effektor ausübt, sich der Erkennung durch das NLR zu entziehen, während er gleichzeitig seine Fähigkeit beibehält, das Pathogenitätsziel zu erzwingen, (2) auf das NLR, neue Effektorvarianten zu erkennen und (3) auf das Pathogenitätsziel, um eine Störung durch den Effektor zu vermeiden und gleichzeitig seine Zellfunktion aufrechtzuerhalten. Die Verdoppelung des Pathogenitätsziels kann es von dieser funktionellen Einschränkung befreien und als „Köder“ für den Effektor dienen. Diese Diversifizierung kann auch dazu führen, dass sich der Lockvogel genetisch wie das Resistenzgen verhält33. Bei etwa 10 % aller NLRs ist der Täuschkörper in den NLR selbst integriert34. Eine solche Guardee-Decoy-Fusion stellt sicher, dass beide Komponenten als eine einzige operative Einheit vererbt werden.

Durch Extrapolation können Proteinkinase-Fusionsproteine Pathogenitätsziele sein, die von NLRs geschützt werden. Alle Proteinkinase-Fusionsproteine haben eine scheinbar funktionelle Kinase, die mit einer zweiten, typischerweise nicht funktionellen Kinasedomäne, manchmal aber auch mit einer völlig anderen Domäne, fusioniert ist, wie zum Beispiel Sr43, Lr9 und Pm4 (Extended Data Abb. 7). Wie bei den NLRs, die einen integrierten Lockvogel tragen, könnte diese zweite Domäne möglicherweise ein integrierter Lockvogel sein, während die scheinbar funktionelle Kinase die Signalfunktion ausübt. Tatsächlich produzieren Pflanzen verschiedene Enzyme, darunter Proteinkinasen mit unterschiedlichen integrierten Domänen, um Reaktionen verschiedener Substrate zu katalysieren. Im Fall von Proteinkinase-Resistenzproteinen würde die integrierte Domäne die spezifischen Substrate der Avr-Proteine des Krankheitserregers definieren, während die Kinase die Phosphorylierung des Avr-Proteins, der integrierten Domäne selbst oder eines dritten Signalpartners katalysieren würde, um eine nachgeschaltete Abwehr auszulösen. ggf. über einen NLR-Guard (Extended Data Abb. 8a). Die EMS-Mutagenese von Yr15, Pm24, Sr62 und Sr43 hat gezeigt, dass Missense-Mutationen überwiegend das aktive Zentrum der Kinase oder die ATP-Bindungstasche der scheinbar funktionellen Kinasedomäne betreffen (Extended Data Abb. 7), was die Annahme stützt, dass es sich um eine durch Kinase vermittelte Signalübertragung handelt für die Funktion erforderlich. Alternativ kann Sr43 (und durch Extrapolation andere Kinase-Fusionsresistenzproteine)35,36 ohne einen NLR-Cosignalisierungspartner funktionieren (Extended Data Abb. 8b).

Die transgene Expression von Sr43 vor einem anderen Hintergrund ermöglichte es uns, die Breitbandwirksamkeit von Sr43 zu bestätigen und seinen potenziellen Wert für die Resistenzzüchtung hervorzuheben. Es ist jedoch möglich, unter Laborbedingungen Virulenz-Erregermutanten zu erhalten, die die AvrSr43-Funktion verloren haben37. Daher sollte Sr43 in Kombination mit anderen Breitspektrum-Resistenzgenen verwendet werden, um seine Langlebigkeit im Feld zu maximieren.

Wir haben 2.700 Samen des Weizens mutagenisiert – Th. Elongatum-Introgressionslinie RWG34 mit Sr43 (Lit. 29). Trockene Samen wurden 16 Stunden lang mit 200 ml einer 0,8 % (Gew./Vol.) EMS-Lösung unter ständigem Schütteln auf einem Rollenmischer (Modell SRT1, Stuart Scientific) inkubiert, um eine maximale homogene Exposition der Samen gegenüber EMS sicherzustellen. Anschließend wurde die überschüssige Lösung entfernt und die Samen dreimal mit 400 ml Leitungswasser gewaschen. Die M1-Samen wurden im Gewächshaus gezüchtet und die Samen der M2-Familien (Einzelköpfe) wurden gesammelt. Acht Samen pro M2-Familie wurden mit dem Pgt-Isolat, Rasse TPMKC, phänotypisiert. Die von anfälligen M2-Pflanzen stammenden M3-Samen wurden ebenfalls getestet, um zu bestätigen, dass es sich bei den M2-anfälligen Pflanzen um echte, nicht segregierende Mutanten handelte. Um eine Samenkontamination auszuschließen, wurden zehn Mutanten mittels Genotyping-by-Sequencing (GBS)38 verifiziert. GBS-Daten aus dem Hintergrund (Chinese Spring), Spenderarten (Th. elongatum, Zugang PI531737 von USDA-ARS GRIN), dem Chinese Spring–Th. Die Introgressionslinie elongatum Sr43 (RWG34) und die mutierten Linien wurden unter Verwendung von BWA mem (v.0.7.12) mit Standardparametern auf die Referenzgenomsequenz von Chinese Spring39 abgebildet. Die Mapping-Ergebnisse wurden sortiert und mit SAMtools41 (v.0.1.19) in das MPileup-Format konvertiert. Die MPileup-Dateien wurden mit einem zuvor veröffentlichten benutzerdefinierten Skript untersucht, das mit Zenodo42 verknüpft war, um den Prozentsatz der Einzelnukleotid-Polymorphismen des Spenders zu berechnen, die pro gegebenem Intervall mit der Introgressionslinie geteilt wurden. Es wurden mehrere Intervalllängen getestet; Für 10-MB-Intervalle wurde ein deutliches Signal beobachtet.

Suspensionen mitotischer Metaphase-Chromosomen wurden aus Wurzelspitzen der Sr43-Introgressionslinie und acht EMS-Mutanten hergestellt, wie in Lit. beschrieben. 43 und Ref. 44. Kurz gesagt, Wurzelspitzenmeristemzellen wurden unter Verwendung von Hydroxyharnstoff synchronisiert, in der Metaphase unter Verwendung von Amiprophos-Methyl akkumuliert und in 2 % (v/v) Formaldehyd bei 5 °C für 20 Minuten fixiert. Intakte Chromosomen wurden durch mechanische Homogenisierung von 100 Wurzelspitzen in 600 µl eiskaltem LB01-Puffer45 freigesetzt. GAA-Mikrosatelliten wurden auf isolierten Chromosomen durch Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung in Suspension (FISHIS) unter Verwendung von 5'-FITC-GAA7-FITC-3'-Oligonukleotiden (Sigma) gemäß Lit. markiert. 46 und chromosomale DNA wurde mit 2 µg ml–1 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) gefärbt. Die Chromosomenanalyse und -sortierung wurde unter Verwendung eines FACSAria II SORP-Durchflusszytometers und -sortierers (Becton Dickinson Immunocytometry Systems) durchgeführt. Für jede Probe wurden bivariate Flusskaryotypen erfasst, in denen die FITC- und DAPI-Fluoreszenz aufgezeichnet wurde, und die Chromosomen wurden mit einer Geschwindigkeit von 20–40 Partikeln pro Sekunde sortiert. Zwei Chargen mit 55.000 und 70.000 Kopien des Chromosoms 7D mit dem Th. Elongatum-Chromosomensegmente, die Sr43 tragen, wurden vom Wildtyp Sr43-WT sortiert und eine Charge von 14.000–66.000 Kopien wurde von den acht Mutanten in PCR-Röhrchen mit 40 μl sterilem entionisiertem Wasser sortiert (Ergänzungstabelle 3).

Der Chromosomengehalt der durchflusssortierten Fraktionen wurde durch mikroskopische Beobachtungen von 1.500–2.000 Chromosomen geschätzt, die in einen 10-μl-Tropfen PRINS-Puffer mit 2,5 % (Gew./Vol.) Saccharose47 auf einem Objektträger sortiert wurden. Luftgetrocknete Chromosomen wurden durch FISH mit Sonden für die pSc119.2-Wiederholung, die Afa-Familienwiederholung und die ribosomale 45S-DNA markiert, was die Identifizierung aller Weizen- und Th-Chromosomen ermöglichte. Elongatum-Chromosomen gemäß Lit. 48. Um den Chromosomengehalt und die Reinheit in den sortierten Fraktionen zu bestimmen, wurden mindestens 100 Chromosomen in jeder durchflusssortierten Probe nach dem in Lit. beschriebenen Karyotyp klassifiziert. 49.

Die beiden getrennt durchflusssortierten Chromosomenproben der Wildtyp-Genotypen wurden zur Erstellung von zwei Sequenzierungsbibliotheken verwendet. Chromosomenproben wurden mit Proteinase K (60 ng μl−1) behandelt, wonach die DNA ohne Amplifikation gereinigt wurde. Aus den Mutanten flusssortierte Chromosomenproben wurden auf ähnliche Weise behandelt, ihr DNA-Gehalt wurde jedoch durch Mehrfachverdrängungsamplifikation (Ergänzungstabelle 3) unter Verwendung eines Illustra GenomiPhi v.2 DNA Amplification Kit (GE Healthcare), wie in Lit. beschrieben, auf 2,5–12,6 μg amplifiziert. 50 und von Novogene sequenziert. Für die Sr43-Wildtyp-Genotypen wurden 20 ng nicht amplifizierte DNA in einem Volumen von 20 μl mit einem Bioruptor Plus (Diagenode) fünfmal für 30 s bei der Einstellung HIGH fragmentiert. Bibliotheken für die Sequenzierung wurden aus fragmentierter DNA unter Verwendung eines NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit für Illumina mit den folgenden Modifikationen vorbereitet: (1) Die Größenauswahl wurde auf eine größere endgültige Bibliotheksgröße (~1.000 bp) ausgerichtet und (2) die PCR-Anreicherung wurde durchgeführt sechs PCR-Zyklen. Bibliotheken wurden auf einer HiSeq2500-Plattform unter Verwendung eines HiSeq Rapid SBS Kit v.2 als 250-bp-Paired-End-Reads sequenziert. Die Rohdaten wurden mit Trimmomatic51 auf Basen geringer Qualität zugeschnitten und mit Meraculous52 (v.2.0.5) unter Verwendung von 111 Nukleotid-k-meren zu Gerüsten zusammengesetzt. Gerüste, die kürzer als 1 kb sind, wurden eliminiert. Die Baugruppe umfasste 168.523 Gerüste mit einer Gesamtbaulänge von 1,29 Gigabase (Gb). Darunter waren 25.581 Gerüste länger als 13,9 KB mit einer Gesamtlänge von 631,8 MB.

Acht anfällige Mutanten aus unabhängigen M2-Familien wurden für die MutChromSeq-Kartierung ausgewählt53. Die Rohdaten der acht Mutanten wurden mithilfe von BWA40 (v.0.7.12) und SAMtools41 (v.1.8) einzeln auf die 10 kb großen, gehackten Gerüstfragmente abgebildet. Es wurde festgestellt, dass ein Fragment in allen Mutanten eine einzelne Nukleotidmutation aufwies. Wir haben die Wahrscheinlichkeit, dass es sich hierbei um das Kandidatengen handelt, mithilfe der von Ref. entwickelten Formel Nummer 4 berechnet. 12, mit 2.598 bp der Sr43-Kodierungssequenz (CDS), unter der Annahme, dass das durchschnittliche Gen-CDS 1.000 bp lang ist und dass Chromosom 7D 5.822 Gene aufweist. Bei allen identifizierten Mutationen handelte es sich um G-zu-A- oder C-zu-T-Übergangsmutationen, die typisch für die EMS-Mutagenese sind.

Die Gesamt-RNA wurde aus dem Chinese Spring–Th extrahiert. Elongatum Sr43-Introgressionslinie mit einem RNeasy Plant Mini Kit (Katalog-Nr./ID 74904, Qiagen) nach dem Protokoll des Herstellers analysiert und mit Dnase I (Roche) verdaut. Die RNA-Seq wurde von Novogene durchgeführt. Die RNA-seq-Reads wurden mit Trimmomatic (http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic) getrimmt. Hisat2 (v.2.1.0)54 wurde verwendet, um die kurzen Lesevorgänge auf die Sr43-Genomsequenz abzubilden. Die SAM-Ausgabedatei wurde mit SAMtools41 (v.1.8) (http://www.htslib.org/) in eine BAM-Datei konvertiert und nach ihrer Position entlang der Sr43-Genomsequenz sortiert und zur Visualisierung durch IGV indiziert (https:/ /software.broadinstitute.org/software/igv/). Um das alternative Spleißen von Sr43 zu bestimmen, haben wir mit einem SMARTer PCR cDNA Synthesis Kit (Katalognr. 634926, Clontech/TaKaRa) eine cDNA-Bibliothek voller Länge erstellt. Transkripte, die jeder der vier Spleißvarianten entsprechen, wurden durch Sanger-Sequenzierung von 20 Klonen identifiziert, die durch Transformation der Langstrecken-PCR in der cDNA-Bibliothek voller Länge mit Primern erhalten wurden, die für die 5'- und 3'-Enden von Sr43 spezifisch sind (Ergänzungstabelle 5).

Auf der Grundlage der Genannotation wurden drei überlappende Segmente des Sr43-Gens PCR-amplifiziert (Ergänzungstabelle 12) mit High-Fidelity-Q5-DNA-Polymerase (NEB) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Die PCR-Produkte wurden mit einem QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN) gereinigt und mit Taq-DNA-Polymerase A-tailiert, bevor sie in den pCR2.1-Vektor (TOPO PCR Cloning Kits-K202020, Thermo Fisher Scientific) kloniert wurden. Die positiven Klone wurden mit drei Sätzen von Restriktionsenzymen, NotI, NotI-PvuI und PvuI-PmeI (NEB), verdaut, um die Sr43-Fragmentteile 1, 2 bzw. 3 zu erzeugen. Die verdauten Fragmente wurden gelgereinigt und dann wurden die Teile 2 und 3 in einer Drei-Wege-Ligationsreaktion mit dem mit NotI und PmeI verdauten binären Vektor pGGG-AH-NotI/PmeI12 unter Verwendung von T4-DNA-Ligase (M0202S, NEB) kombiniert. Anschließend wurde das binäre Konstrukt mit NotI linearisiert und Teil 1 hinzugefügt. Ein positiver Klon mit Teil 1 in der richtigen Ausrichtung, pGGG-Sr43, wurde durch Sanger-Sequenzierung verifiziert. pGGG-Sr43 ist bei Addgene unter der Zugangsnummer 186974 erhältlich.

Das binäre Konstrukt pGGG-Sr43 wurde in Weizen cv transformiert. Fielder nutzt die durch Agrobacterium tumefaciens vermittelte Transformation55. Die Sr43-Kopienzahl wurde durch Testen der Kopienzahl des Hygromycin-B-Phosphotransferase-Selektionsmarkers in T0- und T1-Pflanzen durch iDNA Genetics unter Verwendung von qPCR56 postuliert. Aus einer nicht segregierenden genetisch stabilen T1-Familie haben wir eine T2-Linie (BW_30183) für weitere Kopienzahltests weiterentwickelt. Wir haben genspezifische Primer für Sr43, das selektierbare Markergen der Hygromycin B-Phosphotransferase und endogene Weizenkontrollgene mit Einzelkopie, Dreikopie und Sechskopie entwickelt (Ergänzungstabelle 13). Die Primersequenzen für die endogenen Gene wurden auf Basis des Lebenslaufs entworfen. Fielder-Referenzgenom57. DNA wurde aus einer einzelnen T3-Pflanze (abgeleitet von der T2-Familie BW_30183) unter Verwendung des Qiagen-Genom-DNA-Extraktionskits (Qiagen, Katalog-Nr. 19060) mit 500 Säulen pro g (Qiagen, Charge 169047970) gemäß dem QIAGEN Genomic DNA Handbook extrahiert. Die qPCR wurde in einer 10-μl-Reaktion mit 1X SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix (BioRad), 0,5 μM Primer und 2 ng μl-1 DNA unter Verwendung einer anfänglichen Denaturierung bei 95 °C für 3 Minuten und anschließender Denaturierung bei 95 °C durchgeführt C für 15 s und Annealing + Extension bei 60 °C für 30 s, für 40 Zyklen auf einem CFX96 Real-Time PCR-System. Die Kopienzahl des Sr43-Gens wurde auf Basis der endogenen Referenzgene berechnet (Ergänzungsabbildung 17 und Ergänzungstabelle 14).

Die Stammrosttests wurden im Gewächshaus oder in Wachstumskammern durchgeführt. Die Gewächshaus-/Wachstumskammern wurden bei 21 °C mit einer 14-stündigen Lichtperiode und ~40 % relativer Luftfeuchtigkeit gehalten. Die Pflanzen wurden mit P. graminis f. inokuliert. sp. tritici, wenn das zweite Blatt vollständig ausgebreitet war, 10–12 Tage nach der Aussaat, mit einer Rate von ~0,12 mg Sporen pro Pflanze. Nach einer 16-stündigen Inkubationszeit im Dunkeln unter Bedingungen hoher Luftfeuchtigkeit (100 %) wurden die inokulierten Sämlinge in das Gewächshaus/die Wachstumskammer zurückgebracht und 12–14 Tage später auf ihre Reaktion auf Stammrost untersucht. Die Infektionsarten wurden anhand der Stakman-Skala58 erfasst. Für Temperaturempfindlichkeitstests wurde die Hochtemperatur auf 26 °C eingestellt. Die in dieser Studie verwendeten Pgt-Rassen waren TPMKC (Isolat 74MN1409) aus den Vereinigten Staaten; QTHJC (isoliert 75ND717C und 69MN399) aus den Vereinigten Staaten; TKTTF (Isolat ET11a-18) aus Äthiopien; TTKTT (Isolat KE184a/18) aus Kenia; TKTSC (Isolat IS Nr. 2079), TTTTF (Isolat IS Nr. 2127) und TTTTC (Isolat IS Nr. 2135) aus Israel; TKTTF (Isolat FR68-20) aus Frankreich; TTRTF (Isolat IT16a-18) aus Italien; TKTTF (Isolat UK-01) aus dem Vereinigten Königreich; und TRTTF (Isolat 14GEO189-1) aus Georgia (Ergänzungstabelle 15).

Wir haben InterPro v.88.0 verwendet, um nach Domänen der Proteinfamilie in Sr43 zu suchen, beispielsweise einer Transmembrandomäne59. Um das Vorhandensein von Myristoylierungsstellen und Kernlokalisierungssignalen zu überprüfen, verwendeten wir Myristoylator60 bzw. cNLS-Mapper61 (abgerufen am 11. März 2023).

Wir haben den Open-Source-Code von AlphaFold v.2.0 (Ref. 26) und den Supercomputer der King Abdullah University of Science and Technology, Shaheen II (https://www.hpc.kaust.edu.sa/), über das Multinode-System verwendet Steinbock (https://www.hpc.kaust.edu.sa/ibex). Wir haben die Aminosäuresequenz von Sr43 eingegeben und die Ausgabe bestand aus fünf nicht entspannten, fünf entspannten und fünf bewerteten Modellen im .pdb-Format. Wir haben das Modell „ranked_1.pdb“ verwendet, das die Vorhersagen mit der höchsten Konfidenz enthält, wobei der beste Wert für den lokalen Distanzdifferenztest (lDDT) bei 70,76 liegt. Als nächstes geben wir das von Alphafold erhaltene Ranked_1.pdb-Modell und jede Domäne separat in den Proteinstruktur-Vergleichsserver Dali27 ein.

Wir verwendeten HADDOCK2.4, einen Webserver für das Screening von Bindungsstellen für kleine Moleküle28, um die DUF2-Domäne nach potenziellen ATP-Bindungsstellen zu durchsuchen. Die Eingabedateien bestanden aus der DUF2-Domäne von Sr43 nach dem Entfernen aller Schleifen aus der .pdb-Datei und ATP im .pdb-Format. Die verwendeten Einstellungen waren:

Definieren Sie zufällig mehrdeutige Interaktionsbeschränkungen aus zugänglichen Resten – ON

Anzahl der Strukturen für das Andocken starrer Körper: 10.000

Anzahl der Strukturen für semiflexible Verfeinerung: 400

Anzahl der Strukturen für die endgültige Verfeinerung: 400

Clustering-Methode (RMSD oder Bruchteil gemeinsamer Kontakte (FCC)) – RMSD

RMSD-Grenzwert für Clustering (empfohlen: 7,5 A für RMSD, 0,60 für FCC) – 2,0

Evdw 1–1,0

Eelec 3 – 0,1

Anfangstemperatur für den zweiten TAD-Kühlschritt mit flexibler Seitenkette an der Schnittstelle – 500

Anfangstemperatur für den dritten TAD-Kühlschritt mit vollständig flexibler Schnittstelle – 300

Anzahl der MD-Stufen für Starrkörper-Hochtemperatur-TAD – 0

Anzahl der MD-Schritte während der ersten Abkühlphase des starren Körpers – 0

Die Ausgabedateien waren zehn Cluster verschiedener vorhergesagter ATP-Bindungsstellen. Der Cluster mit dem besten Vorhersagewert (Z-Score) war Cluster 6.

Das native CDS von Sr43 plus zwei zusätzliche Nukleotide (CC) am Anfang des CDS (um den offenen Leserahmen mit His6-Tag aufrechtzuerhalten) wurde kommerziell synthetisiert (Twist Bioscience) und in den Gateway-Eintrittsvektor pTwist_ENTR kloniert. Zur rekombinanten Proteinexpression wurde Sr43 durch Gateway-LR-Clonase-Reaktion (Invitrogen) in den Expressionsvektor pDEST-His6-MBP übertragen. Der resultierende Klon wurde durch Sanger-Sequenzierung verifiziert.

Das mit His6-MBP-Sr43 markierte Protein wurde im E. coli Rosetta-Stamm exprimiert, indem die Bakterienkultur bei 37 °C auf eine optische Dichte OD600 von 0,8 gezüchtet und dann die Proteinexpression durch Zugabe von 0,5 mM Isopropyl-β-d-thiogalactopyranosid induziert wurde 18 °C und weitere Inkubation der Kultur für 14–16 Stunden. Das rekombinante Protein wurde unter nativen Bedingungen unter Verwendung von Ni-NTA-Agarosekügelchen (Invitrogen Katalog-Nr. R901-15) gemäß den Anweisungen des Herstellers gereinigt.

Die Pufferzusammensetzung des gereinigten His6-MBP-Sr43-Proteins wurde mithilfe von PD10-Entsalzungssäulen (GE Gesundheitspflege). His6-MBP-Sr43 wurde mit einem kommerziellen Substrat-Maltose-bindenden Protein-DNA-Gyrase (Prospec Protein Specialists PRO-616) gemischt und 30 Minuten bei Umgebungstemperatur inkubiert. Nach Zugabe von SDS-Probenpuffer zum Stoppen der Reaktion wurde das Protein durch 10-minütiges Kochen bei 95 °C denaturiert. Zur Auflösung von Proteinproben wurde SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese eingesetzt. Das Gel wurde mit SimplyBlue SafeStain (Novex Kat.-Nr. LC6065) gefärbt und die Bande, die dem Protein von Interesse entsprach, wurde herausgeschnitten, in Stücke von 0,5 mm3 geschnitten und mit vier aufeinanderfolgenden Waschgängen von jeweils 15 Minuten mit Acetonitril und 100 mM NH4HCO3 entfärbt . Die Proteine in den Gelstücken wurden mit 10 mM Tris(2-carboxyethyl)phosphinhydrochlorid (TCEP, C-4706 Sigma) in 100 mM NH4HCO3 bei 37 °C 1 Stunde lang reduziert. Anschließend wurden die reduzierten Disulfidbindungen mit 50 mM Iodacetamid 30 Minuten lang bei Umgebungstemperatur alkyliert. Nach der Reduktion und Alkylierung der Proteine wurden sie über Nacht bei 37 °C mit Trypsin (Schweinetrypsin, Promega) verdaut. Ameisensäure wurde bis zu einer Endkonzentration von 1 % zugesetzt, um den Verdau zu stoppen, und die tryptischen Peptide wurden durch Inkubation der Gelstücke in Acetonitril gewonnen. Die gewonnenen Peptide wurden unter Verwendung einer Sep-Pak C18 1 ml Vakuumkartusche (Waters SKU: WAT023590) entsalzt und durch Flüssigkeitschromatographie mit Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) analysiert (ergänzende Abbildung 14). Peptidproben wurden mithilfe einer C18-Säule getrennt, die mit einem Orbitrap Fusion Lumos-Massenspektrometer verbunden war (Acclaim PepMap C18, 25 cm Länge, 75 m ID, 3 m Partikelgröße, 100 Porosität, Dionex). Der LC-Gradient stieg innerhalb von 45 Minuten von 5 % Lösungsmittel B (Wasser/ACN/Ameisensäure, 20/80/0,1, v/v/v) auf 45 % Lösungsmittel B und dann 10 Minuten lang auf 90 % Lösungsmittel B. Mithilfe der HCD-Fragmentierung im Orbitrap Fusion Lumos-Instrument zeichnete das MS-Instrument Fragmentierungsspektren der zehn wichtigsten Peptide auf. Mithilfe der msConvert-Schnittstelle wurden die RAW-Datendateien in MGF-Dateien konvertiert. Der Mascot-Server wurde zur Durchführung von Datenbanksuchen verwendet und die folgenden Kriterien wurden verwendet: (1) Datenbank mit den Aminosäuresequenzen von Sr43, MBP und kontaminierenden Proteinen; (2) enzymatische Spezifität (Trypsin erlaubt zwei erlaubte fehlende Spaltungen); (3) Cysteinreste sind fest modifiziert (Carbamidomethyl); (4) die Phosphorylierung von S-, T- und Y-Resten kann variabel modifiziert werden; (5) Vorläufermassen sind bis zu 5 ppm tolerierbar; (5) Fragmentionen sind bis 0,02 Da tolerierbar. Zur Filterung der Ergebnisse wurden Maskottchen- und MD-Scores verwendet. Die zur Bestimmung der Proteinabdeckung von Maltose-bindenden Proteinen identifizierten Peptide werden bei alleiniger Inkubation und bei Inkubation mit His6-MBP-Sr43 gezeigt (Ergänzende Abbildungen 15 und 16).

Um das 35S:Sr43-GFP-Konstrukt zu erzeugen, wurde ein Codon-optimierter offener Leseraster der Sr43-Spleißversion 1 synthetisiert und in pDONR221 (Twist Bioscience) ligiert. Der Eintrittsklon wurde dann durch eine einzelne Gateway-LR-Reaktion (Invitrogen) in den binären Vektor pB7FGW2,0 eingeführt. Das 35S:PLSP2A-mRFP-Konstrukt wurde durch Kombination eines Entry-Klons des PLSP2A-CDS mit dem p35S-Promotor und dem mRFP-Fluoreszenzreporter unter Verwendung sequenzieller Gateway-Klonierung erzeugt.

Die 35S:Sr43-GFP- und 35S:PLSP2A-mRFP-Konstrukte wurden in den A. tumefaciens-Stamm GV3101 übertragen und in Tabakblätter infiltriert, wie in Lit. beschrieben. 62. Das GFP-Signal wurde bei 488 nm angeregt und zwischen 500 und 535 nm nachgewiesen. Das mRFP-Signal wurde bei 555 nm angeregt und zwischen 566 und 646 nm nachgewiesen. Die Bilder wurden mit einem invertierten Leica SP8 Stellaris FALCON mit einem HC PL APO 63× 1,2 W CORR UVIS CS2 Objektiv aufgenommen.

Um das pZmUbi:GFP-Sr43-Konstrukt zu erzeugen, wurde das Sr43-CDS der Spleißversion 1 aus dem oben erwähnten pDONR221 in den pJET1.2-Vektor (Thermo Fisher) als Level-I-Modul für die weitere Golden-Gate-Klonierung subkloniert63. Das Level-II-Expressionskonstrukt wurde mit dem Level-II-Rückgrat (BB10), dem Level-I-ZmUbiquitin-Promotor, dem Level-I-GFP-Tag, dem Level-I-Sr43 und dem Level-I-NOS-Terminator über eine BsaI-Schnittligationsreaktion zusammengesetzt63. Das pZmUbi:NLS-mCherry-Konstrukt wurde auf die gleiche Weise durch Kombination des Level-II-Rückgrats, des Level-I-ZmUbqiuitin-Promotors, der Level-I-Kernlokalisierungssequenz, des Level-I-mCherry und des Level-I-NOS-Terminators erzeugt. Die pZmUbi:GFP-Kontrolle wurde durch Übertragung des GFP-CDS über die LR-Clonase-Reaktion auf pZmUbi:GW64 erzeugt.

Plasmid-DNAs wurden aus E. coli, das pZmUbi:GFP-Sr43, pZmUbi:NLS-mCherry, pZmUbi:GFP enthielt, mit dem NucleoBond Xtra Maxi Plus Kit (Macherey-Nagel) gereinigt. Mesophyllzellen wurden aus 9 Tage alten Weizensämlingen (Sorte Fielder) isoliert, die unter Kurztagbedingungen (8 Stunden Licht, 16 Stunden Dunkelheit) gezüchtet wurden. Die Isolierung und Transfektion von Protoplasten wurde wie in Lit. beschrieben durchgeführt. 64.

Die Fluoreszenz wurde mit einem konfokalen Carl Zeiss LSM 880 Axio Imager 2-Konfokalmikroskop mit einem Plan-Apochromat 63×/1,4 Oil DIC M27-Objektiv beobachtet. GFP wurde mit einem Argonlaser (488 nm) angeregt und zwischen 494 und 552 nm nachgewiesen. Der mCherry wurde mit einem diodengepumpten Festkörperlaser (561 nm) angeregt und eine Fluoreszenz zwischen 596 und 649 nm festgestellt.

Wir haben einen phylogenetischen Baum auf der Grundlage der abgeglichenen Proteinsequenzen der 100 besten Treffer (ID ≥ 75 %) der Kinasedomänensequenz und der Sr43-DUF-Regionssequenz mit der NCBI-Proteindatenbank erstellt. Der phylogenetische Baum (Neighbor-Joining-Methode) für Kinase- und DUF-Domänen wurde mit Clustal Omega (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/) berechnet und mit iTOL (https://itol) gezeichnet. embl.de/).

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die im Rahmen der aktuellen Studie generierten und/oder analysierten Datensätze sind wie folgt öffentlich verfügbar. Die Sequenzablesungen wurden im Europäischen Nukleotidarchiv unter den Projektnummern PRJEB52878 (GBS-Daten), PRJEB51958 (Chromosomenflusssortierte Daten) und PRJEB52088 (RNA-seq-Daten) hinterlegt. Das Sr43-Gen und die Transkriptsequenz wurden in der NCBI Genbank unter der Zugangsnummer ON237711 hinterlegt. Die Sr43-Chromosomenanordnung wurde in Zenodo hinterlegt (https://doi.org/10.5281/zenodo.6777941). Die folgenden öffentlichen Datenbanken/Datensätze wurden in der Studie verwendet: Chinese Spring reference genome39, Gramene (http://www.gramene.org/), https://ensembl.gramene.org/Multi/Tools/Blast, https:/ /wheat.pw.usda.gov/GG3/blast, BLAST nicht-redundante Proteinsequenz (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastx&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome), Taxonomie-Browser ( https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=1437183), AlphaFold26 (https://alphafold.ebi.ac.uk), Dali27 (http://ekhidna2. biocenter.helsinki.fi/dali/) und HADDOCK28 (https://www.bonvinlab.org/education/HADDOCK-binding-sites/.

Die in diesen Analysen verwendeten Skripte wurden in GitHub (https://github.com/steuernb/GBS_introgression_line_analysis) veröffentlicht und mit Zenodo (https://zenodo.org/badge/latestdoi/394326594)42 verknüpft.

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Referenzen herunterladen

Wir danken Y. Wang für seine Hilfe bei der Phänotypisierung und Zusammenstellung der Ergänzungstabelle 19; ES Vande Loo für die Medienvorbereitung; H. Zhang und AW Weatherhead für Hilfe bei der Massenspektrometrie (alle KAUST, Saudi-Arabien); Y. Jin (USDA-ARS, Minnesota, USA) für die Verwendung der Pgt-Isolate 74MN1409, 75ND717C, 69MN399 und 14GEO189-1; M. van Slageren (Kew, UK) für Hilfe bei der Artennomenklatur; S. Saile und L. Rohr (Universität Tübingen, Deutschland) für pZmUbi- und NLS Golden Gate-Module; Z. Dubská, R. Šperková und J. Weiserová für die Vorbereitung von Chromosomenproben für die Durchflusszytometrie; und M. Said und P. Cápál für die Chromosomensortierung (alle IEB, Tschechische Republik). Diese Forschung wurde von der NBI Research Computing Group und der Informatics Platform am John Innes Centre, Großbritannien, unterstützt und durch Mittel der 2Blades Foundation, USA, an BJS und BBHW finanziert; der Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC) zur Gestaltung eines künftigen institutsübergreifenden strategischen Programms für Weizen an BBHW (BBS/E/J/000PR9780); Marie-Curie-Stipendium „AEGILWHEAT“ (H2020-MSCA-IF-2016-746253) und das Ungarische Nationale Büro für Forschung, Entwicklung und Innovation (K135057) an IM; EFRE-Projekt „Pflanzen als Werkzeug für eine nachhaltige globale Entwicklung“ (Nr. CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_019/0000827) an JB, KH, MK und JD; King Abdullah University of Science and Technology an BBHW, Ł.J., IB und HH; die Lieberman-Okinow-Stiftung der University of Minnesota an BJS; der Daimler und Benz Stiftung, von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) CEPLAS (EXC 2048/1 – Projekt-ID: 390686111) und dem DFG Emmy Noether Programm (SA 4093/1-1) an IMLS; die Gordon and Betty Moore Foundation durch den Zuschuss GBMF4725 an die 2Blades Foundation und JDGJ; und die Gatsby Charitable Foundation an JDGJ

T. Lynne Reuber

Derzeitige Adresse: Enko Chem, Mystic, CT, USA

István Molnár

Derzeitige Adresse: Zentrum für Agrarforschung, ELKH, Agrarinstitut, Martonvásár, Ungarn

Plant Science Program, Biological and Environmental Science and Engineering Division (BESE), King Abdullah University of Science and Technology (KAUST), Thuwal, Saudi-Arabien

Guotai Yu, Naganand Rayapuram, Fatimah R. Aljedaani, Catherine Gardener, Jesse Poland, Heribert Hirt, Ikram Blilou und Brande BH Wulff

Zentrum für Wüstenlandwirtschaft, KAUST, Thuwal, Saudi-Arabien

Guotai Yu, Naganand Rayapuram, Fatimah R. Aljedaani, Catherine Gardener, Jesse Poland, Heribert Hirt, Ikram Blilou und Brande BH Wulff

John Innes Centre, Norwich Research Park, Norwich, Großbritannien

Guotai Yu, Catherine Gardener, Yajuan Yue, Ngonidzashe Kangara, Burkhard Steuernagel, Sadiye Hayta, Mark Smedley, Wendy Harwood und Brande BH Wulff

Abteilung für Pflanzenpathologie, University of Minnesota, St. Paul, MN, USA

Oadi Matny, Ryan Johnson, Matthew N. Rouse und Brian J. Steffenson

Biowissenschaftliches Programm, Smart Health Initiative, BESE, KAUST, Thuwal, Saudi-Arabien

Spyridon Gourdoupis & Lukasz Jaremko

Abteilung für Pflanzenbiochemie, Zentrum für Pflanzenmolekularbiologie (ZMBP), Universität Tübingen, Tübingen, Deutschland

Yan L. Wang & Thorsten Nürnberger

Institut für Pflanzenwissenschaften, Universität zu Köln, Köln, Deutschland

Emma E. Crean & Isabel M.-L. Saur

Exzellenzcluster für Pflanzenwissenschaften (CEPLAS), Köln, Deutschland

Isabel M.-L. Saur

Abteilung für Agrarökologie, Universität Aarhus, Slagelse, Dänemark

Mehran Patpour

Abteilung für Pflanzenpathologie, Kansas State University, Manhattan, KS, USA

Shuangye Wu & Jesse Polen

Das Sainsbury Laboratory, University of East Anglia, Norwich, Großbritannien

Jonathan DG Jones

2Blades Foundation, Evanston, IL, USA

T. Lynne Reuber

Institut für Getreideforschung, Universität Tel Aviv, Tel Aviv, Israel

Moshe Ronen

Institut für Getreideforschung und Fakultät für Pflanzenwissenschaften und Ernährungssicherheit der Universität Tel Aviv, Tel Aviv, Israel

Amir Scharon

USDA-ARS, Cereal Disease Laboratory, St. Paul, MN, USA

Matthew N. Rouse

Forschungseinheit für Pflanzenverbesserung und Genetik, USDA-ARS, Western Regional Research Center, Albany, CA, USA

Steven Xu

Zentrum der Region Haná für biotechnologische und landwirtschaftliche Forschung, Institut für experimentelle Botanik der Tschechischen Akademie der Wissenschaften, Olomouc, Tschechische Republik

Kateřina Holušová, Jan Bartoš, István Molnár, Miroslava Karafiátová und Jaroslav Doležel

Forschungszentrum des Roten Meeres, BESE, KAUST, Thuwal, Saudi-Arabien

Lukasz Jaremko

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GY erzeugte die Mutantenpopulation. RJ-, BJS- und NK-gescreente und verifizierte Mutanten. Genotypisierte BS-, SW- und JP-Mutanten. IM, MK und JD führten eine Chromosomenflusssortierung und -amplifikation durch. GY, KH und JB führten die Chromosomenmontage durch. GY führte bioinformatische Analysen durch, um Sr43 zu identifizieren. GY extrahierte RNA und bestimmte die Sr43-Genstruktur und alternatives Spleißen. GY, SG und Ł.J. kommentiert Sr43. SG und Ł.J. führte 3D-Modellierungsanalysen durch. MS hat den binären Vektor entwickelt. GY hat das Sr43-Konstrukt entwickelt. SH und WH wandelten Sr43 in Weizen um. GY, OM, MP und MNR phänotypisierten die transgenen Linien. FRA und IB (in N. benthamiana) und YLW, EEC, TN und IM-LS (in Weizen) bestimmten die Sr43-Lokalisierung. NR und HH führten einen Kinase-Assay durch. GY führte Phylogenetik und Syntenie durch. OM, SX, MNR, MR, AS, JDGJ, CG, YY und TLR stellten Keimplasma, Rostkulturen oder wissenschaftliche Unterstützung und Beratung zur Verfügung. BBHW, GY und BJS haben die Studie konzipiert. GY und BBHW haben das Manuskript verfasst. Alle Mitautoren haben das endgültige Manuskript gelesen und genehmigt. Mit Ausnahme der ersten sechs und letzten sechs Autoren werden die Autoren in der Autorenliste nach Institutionen gruppiert.

Korrespondenz mit Brian J. Steffenson oder Brande BH Wulff.

GY und BBHW sind Erfinder der von 2Blades eingereichten vorläufigen US-Patentanmeldung 63/250.413, die sich auf die Verwendung von Sr43 zur Stängelrostresistenz in transgenem Weizen bezieht. TLR war bei der 2Blades Foundation angestellt, die die Arbeit mitfinanzierte. Die übrigen Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Nature Genetics dankt Tzion Fahima, Zhiyong Liu und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Das Punktdiagramm von DAPI (x-Achse) vs. FITC (y-Achse) wurde nach der Analyse von DAPI-gefärbten Chromosomensuspensionen erhalten, die von FISHIS mit FITC-konjugierten Sonden für GAA- und ACG-Mikrosatelliten markiert wurden. Die 7D/7el2-Translokationschromosomen wurden anhand des als rotes Rechteck dargestellten Sortierfensters bei Reinheiten von 60–65 % sortiert. Einschub: 7D/7el2-Translokationschromosom nach FISH mit Sonden für pSc119.2-Repeat (grün), Afa-Familien-Repeat (rot) und 45S-rDNA (gelb), die zur Identifizierung von Chromosomen in der sortierten Fraktion verwendet wurde. Chromosomen wurden mit DAPI (blau) gegengefärbt.

a, Kartierung von RNA-seq-Reads vom Blatttranskriptom auf den Sr43-Locus. b, mRNA-Spleißvarianten, identifiziert durch Sequenzierung von cDNA-Klonen voller Länge. Introns und Exons werden durch Linien bzw. Kästchen dargestellt. Die Spleißvarianten 1, 2, 3 und 4 weisen jeweils 8, 7, 5 und 6 EMS-induzierte Mutationen in der kodierenden Sequenz auf.

a, Agrobacterium-vermittelte transiente Expression eines Sr43-GFP-Fusionskonstrukts oder eines GFP-Konstrukts, gesteuert durch den 35 S-Promotor des Blumenkohlmosaikvirus (CaMV) in Nicotiana benthamiana. Die GFP-Fluoreszenz in Epidermiszellen wurde 3 Tage nach der Infiltration durch konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie aufgezeichnet. b, Agrobacterium-vermittelte transiente Expression des 35 S:Sr43-GFP mit einem 35 S:PLSP2A-RFP-Plastidenmarkerkonstrukt in N. benthamiana. Die GFP- oder RFP-Fluoreszenz in Epidermiszellen wurde 3 Tage nach der Infiltration durch konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie aufgezeichnet. c, vorübergehende Expression eines ZmUbi:GFP-Sr43-Fusionskonstrukts mit ZmUbi:NLS-mCherry-Kernmarker in Weizenmesophyllzellen (oberes Feld) und einem ZmUbi:GFP als Kontrolle (unteres Feld). Die GFP- und mCherry-Fluoreszenz wurde 16–20 Stunden nach der Transfektion mittels konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie aufgezeichnet. Eine nicht transformierte Zelle wird durch einen schwarzen Pfeil angezeigt. Der Maßstabsbalken in allen Bildern beträgt 20 µm. Kerne (N), Zytoplasma (C) und Plastiden (P) sind auf den Bildern mit weißen Pfeilen gekennzeichnet. Die Größen der GFP- und Sr43-GFP-Fusionsproteine werden auf 27 bzw. 126 kDa geschätzt. Die Experimente wurden in fünf (Sr43-GFP, Panel a), zwei (GFP, Panel b), drei (Panel b), fünf (GFP-Sr43) bzw. zwei (GFP) unabhängigen Experimenten mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt. In den N.-benthamiana-Experimenten haben wir zwei Blätter infiltriert und mehr als 100 Kerne pro Blatt gescreent.

a, homozygote transgene Linien der Generation T1 neben der nicht-transgenen Elternsorte Fielder. b, Homozygote transgene Linien und Null-Segreganten aus der Generation T2. Maßstabsleiste, 1 cm.

Es wurde ein Mindestschwellenwert von 94 % Abdeckung und eine Identität von ≥60 % angewendet. ATSS, Aegilops tauschii subsp. erdrosselt HVSV, Hordeum vulgare subsp. vulgär; LR, Lolium rigidus; OS, Reis-Sativa; PV, Panicum virgatum; SI, italienische Setaria; TA, Sommerweizen; TD, Triticum dicoccoides; TTSD, Triticum turgidum subsp. hart ZM, Zea Mays.

Es wurde ein Mindestschwellenwert von ≥99 % Abdeckung und eine Identität von ≥70 % angewendet. ATSS, Aegilops tauschii subsp. erdrosselt BD, Brachypodium distachyon; DE, Exile Digitaria; EC, Eragrostus curvula; HV, Bardeum vulgare; HVSV, Hordeum vulgare subsp. vulgär; LR, Lolium rigidus; ML, Miscanthus lutarioriparius; OB, Oryza brachyantha; OMVG, Oryza meyeriana var. granuliert OS, Reis-Sativa; OSIG, Indian Rice Group; OSJG, Rice Sativa Japonica Group; PH, Panicum hallii; PHVH, Panicum hallii var. der Halle; PM, Panicum miliaceum; PV, Panicum virgatum; SI, italienische Setaria; SV, Setaria verdi; SB, Sorghum zweifarbig; TA, Sommerweizen; TD, Triticum dicoccoides; TTSD, Triticum turgidum subsp. hart Du, der Weizen in der Hitze; ZM, Zea mays; ZP, Sumpfunkräuter.

Die ATP-bindenden und aktiven Stellen der Kinasen werden durch Kästchen und Kreise in den aktiven bzw. Pseudokinasen angezeigt, wie durch Interpro-Scanning, Homologiesuche in von AlphaFold abgeleiteten 3D-Modellen und/oder BLAST bestimmt. Weiße Balken zeigen Missense-Mutationen mit Funktionsverlust an, die aus EMS-Mutanten-Screens erhalten wurden. Acht Mutationen in den Linkerdomänen werden nicht angezeigt. Die Proteine sind von oben nach unten nach Veröffentlichungsdatum geordnet: Rpg1, Yr36, Tsn1, Rpg5, Yr15, Sr60, Pm24, Sm1, Snn3, Pm4 (kodiert durch Spleißversion 2), WTK4, Rwt4, Sr62 (Ref. 9, 10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21), Sr43 (diese Studie) und Lr9 (Lit. 22). START, Steroidogener akuter regulatorischer Protein-bedingter Lipidtransfer; NLR, Nukleotidbindung und Leucin-reiche Wiederholung; MSP, Hauptspermienprotein; C2, C2-Domäne; PRT C, C-terminale Domäne der Phosphoribosyltransferase; DUF, Domäne unbekannter Funktion; vWA, Von-Willebrand-Faktor-Typ-A-Domäne. Weiße Balken zeigen die Position von EMS-abgeleiteten Funktionsverlustmutationen (ausgenommen frühe Stop-Codon-Mutationen) an, sofern diese verfügbar sind. Die Zahl 9 unter dem aktiven Zentrum in der aktiven Kinase von Lr9 zeigt das Vorhandensein von neun Mutationen an.

Das Proteinkinase (PK)-Fusionsprotein enthält einen integrierten Lockvogel (ID), der das Avirulenzeffektorprotein (rotes Quadrat) einfängt. Dies löst eine Autophosphorylierung entweder der Proteinkinase oder des Decoys, des Effektors oder des nukleotidbindenden Leucin-Rich-Repeat-Schutzes (NLR) aus. Dies führt zu einer Konformationsänderung, die wiederum eine Signalkaskade auslöst, die zu nachgeschalteten Abwehrreaktionen und Immunität führt.

Ergänzende Abbildungen. 1–17.

Ergänzungstabellen 1–20

Dreidimensionales Modell von Sr43, wie von AlphaFold vorhergesagt.

Dreidimensionales Modell von Sr43 mit ATP, wie von AlphaFold vorhergesagt.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Yu, G., Matny, O., Gourdoupis, S. et al. Das Weizenstammrost-Resistenzgen Sr43 kodiert für eine ungewöhnliche Proteinkinase. Nat Genet (2023). https://doi.org/10.1038/s41588-023-01402-1

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Eingegangen: 3. Juli 2022

Angenommen: 18. April 2023

Veröffentlicht: 22. Mai 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41588-023-01402-1

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Naturgenetik (2023)